EPS對肺動脈高壓大鼠右心室重構的影響及機制

李瑞敏，丁艷艷，張永祥

(首都醫科大學大興教學醫院呼吸與危重癥醫學科，北京 大興 102600)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一種致死率極高的慢性肺循環疾病，病理生理機制為肺循環阻力的增加，引起右心室后負荷增加，導致右心室重構，嚴重時誘發右心衰竭，甚至造成死亡[1]。因此尋求療效確切且能有效改善肺血管及右心室重構的藥物具有重要意義[2]。

研究表明[3]，野百合堿(monocrotaline,MCT)可以誘導PAH大鼠右室心肌氧含量降低、心肌細胞線粒體氧耗上調。依帕司他(epalrestat，EPS)是典型的醛糖還原酶選擇性抑制劑，研究發現EPS具有降壓、抑制血管平滑肌細胞增殖和血管重構等作用[4-5]，本文擬研究EPS對MCT誘導的肺動脈高壓大鼠右心室重構的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

選取SD大鼠80只，體質量180～200 g，10周齡，購自蘇州工業園區愛爾麥特科技有限公司，許可證號：SDK(蘇)2009-0001；所有大鼠飼養于標準鼠籠，每籠5只，室溫22～25 ℃，濕度35%～50%，自由攝食及飲水，適應性喂養1周后進行試驗，隨機分為對照組、模型組、50 mg/kg EPS，100 mg/kg EPS組，每組20只。

1.2 實驗方法

1.2.1 肺動脈高壓大鼠模型建立 按照經典方法給予SD大鼠60mg/kg皮下注射野百合堿構建PAH大鼠模型，對照組皮下注射等量的生理鹽水。造模過程中的28天內，模型組共自發性死亡大鼠7只，死亡率為35%。

1.2.2 藥物干預 首先用蒸餾水將磨成粉末狀的EPS稀釋成混懸液，自注射MCT之日起，分別給予50 mg/kg EPS，100 mg/kg EPS，模型組給予等量的生理鹽水。一直持續28天，并全程密切觀察大鼠的一般情況和生存狀態并記錄。

1.2.3 血流動力學指標測定 首先用60 mg/kg的戊巴比妥鈉溶液腹腔注射麻醉大鼠，將直徑為0.5 mm的聚乙烯PE導管連接上壓力換能器并經右頸外靜脈插入右心室及肺動脈，MedLab-TA6008多導生理記錄儀(南京美易科技有限公司生產)分別記錄右心室收縮壓(RVSP)、平均肺動脈壓(mPAP)和肺動脈收縮壓(PASP)[6]。

1.2.4 組織標本處理及測定

上一步結束后，打開胸腔暴露心和肺，在右心室剪一小口，并剪開左房，將連于灌注裝置的磨平的針頭經右心室插入至肺動脈，開啟灌注裝置，用生理鹽水沖洗肺至干凈，取出心臟，去掉大血管和心房，分離左、右心室，濾紙吸干表面水分，稱RV重及LV+SEP重，并計算右心室肥厚指數(RVHI)，右心室質量指數(RVMI)[7]。將右心室心尖處組織置于4%多聚甲醛固定2天，用于制備石蠟切片;準確稱取100 mg右心室組織置于液氮中研磨并加入1 mL Trizol試劑進行裂解，置于-80℃冰箱保存；剩余右心室置于液氮中研磨，并在冰上用裂解液對組織裂解30 min，于4 ℃ 12 000 r/min離心10 min后提取蛋白，檢測相關蛋白表達水平。

1.2.5 HE觀察

用4%多聚甲醛固定大鼠右心室心尖部48 h，石蠟包埋切片，進行HE染色，具體操作步驟如下：將石蠟切片置于烘箱中60 ℃烤1～2 h；石蠟切片常規二甲苯，乙醇脫蠟至水，蘇木素染10 min，流水沖洗，去余色，7%鹽酸乙醇分化數秒鐘，流水沖洗，切片變藍約15 min，95%乙醇30 s，酒精性伊紅染30 s，95%乙醇30 s兩次，100%乙醇30 s兩次，石碳酸二甲苯30 s，二甲苯30 s兩次，中性樹膠封片[8]。

1.2.6 免疫組化染色

免疫組化染色采用鏈霉素蛋白-生物素免疫染色法。首先常規石蠟切片脫蠟水化，PBS洗滌3 min，滴加0.3%H2O2，并于37 ℃孵育20 min，再用PBS洗滌3 min后用正常血清封閉20 min，接著一抗孵育過夜(4 ℃)，用PBS洗滌3 min，用二抗室溫37 ℃孵育0.5 h，用PBS洗滌，滴加辣根過氧化物酶標記鏈酶卵白素工作液，并室溫孵育0.5 h，PBS洗滌3 min，DAB顯色，蘇木素復染，常規脫水、透明。中性樹膠封片。染色過程中用PBS緩沖液取代一抗作為空白對照[9]。

1.3 統計學處理

2 結 果

2.2 大鼠血流動力學指標

與對照組相比，RVSP、mPAP和PASP在模型組顯著增高，給予EPS后RVSP、mPAP和PASP顯著降低，并呈劑量依賴效應。見表1。

表1 各組大鼠血流動力學指標比較

2.3 大鼠右心室重構指標

與對照組比較，模型組RVHI和RVMI顯著增加，給予EPS干預后，RVHI和RVMI顯著降低，并呈劑量依賴效應。見表2。

2.4 大鼠右心室心肌HE染色

對照組右心室心肌纖維排列整齊，胞漿染色均勻，胞核位于中央，呈卵圓形，核膜邊界清楚；模型組心肌纖維排列紊亂，橫紋消失，心肌細胞肥大，部分胞核寬大畸形；EPS組心肌形態學改變較模型組有所改善，其中高劑量組好于低劑量組。見圖1。

表2 各組大鼠右心室重構指標比較

圖1 右心室心肌HE染色觀察(200×)A：對照組；B：模型組；C：50 mg/kg EPS組；D：100 mg/kg組

2.5 各組右心室心肌Cx43表達

與對照組比較，模型組Cx43光密度顯著降低，給予EPS干預后，Cx43光密度顯著增高，并呈劑量依賴效應。說明PAH大鼠右心室心肌Cx43表達降低，EPS逆轉右心室重構與增加Cx43表達有關。見表3和圖2。

表3 各組大鼠右心室心肌Cx43比較

圖2 Cx43免疫組化染色(200×)A：對照組；B：模型組；C：50 mg/kg EPS組；D：100 mg/kg組

3 討 論

MCT是從野百合中提取的一種雙稠吡咯類生物堿，本身是無活性的，在大鼠肝臟內經P450氧化酶可轉化為有活性的脫氫產物野百合堿吡咯，可以選擇性作用于肺血管床[10]。MCT可選擇性地損傷肺血管內皮細胞，引起肺小動脈平滑肌細胞進行性增殖、肺動脈血管內栓塞形成、誘導肺小動脈肌化和重構、降低內膜完整的肺血管數量、升高肺阻力，最終導致肺動脈高壓[11]。皮下注射MCT是公認的用于研究肺動脈高壓、非原發于心臟的右心室重構和右心衰竭的方法[12]，本實驗結果也證明，采用MCT能成功構建肺動脈高壓和右心室重構的動物模型。醛糖還原酶(AR)是多元醇通路的關鍵酶，具有NADPH依賴性。AR被激活后可以使NADPH/NADP+比值下降，從而降低抗氧化能力，進而增強氧化應激反應。有研究發現，AR/NADPH氧化酶-4(NOX-4)介導的氧化應激在肺動脈高壓右心室重構中發揮了重要的作用[13]。EPS為AR抑制劑，可通過抑制AR表達，抑制NOX-4介導的氧化應激反應，從而改善肺動脈高壓大鼠右心室重構。本實驗結果發現，在實驗造模的28天內，模型組共自發性死亡大鼠7只，死亡率為35%，對照組、EPS組無大鼠死亡，說明EPS可以降低MCT誘導的肺動脈高壓大鼠的死亡率，也間接地說明EPS可以減輕肺動脈高壓對大鼠的病死率。從血流動力學指標(RVSP、mPAP和PASP)可以看出，由高到低的是模型組、EPS組、對照組，說明示EPS具有降低PAH大鼠肺動脈壓力的作用。從右心室重構指標可以看出，與對照組相比，模型組RVHI和RVMI明顯升高，說明MCT成功制造肺動脈高壓模型和右心室重構模型，給予EPS干預后，PAH大鼠右心室重構得到抑制。通過對大鼠的右心室心肌進行HE染色，結果說明肺動脈高壓大鼠的右心室心肌紊亂，EPS在抑制肺動脈高壓同時，也能改善心肌結構。Cx43是哺乳類動物心室工作細胞最重要的縫隙連接蛋白，它的正常表達和分布是心肌細胞正常活動及協調舒縮的重要保證[14]。當壓力負荷持續存在時(例如肺動脈高壓)，Cx43的密度會比正常減少40%，本實驗結果顯示，模型組Cx43的表達顯著降低、注射EPS后Cx43的表達顯著增加。結合前面結果，我們推測EPS可能是通過上調了Cx43表達量逆轉肺動脈高壓大鼠右心室重構[15]。

綜上所述，EPS可以減輕MCT誘導的PAH大鼠右心室重構，其機制可能與增加右心室心肌Cx43表達，抑制醛糖還原酶作用有關。