牛初乳通過調節腸道菌群對小鼠潰瘍性結腸炎的改善作用

鄭慧怡，馬芙蓉，羅曉清，張 瑜，金盈圻，賀慶芝

(1.南華大學衡陽醫學院,湖南 衡陽 421001;2.桂林醫學院生物技術學院,廣西 桂林 541199)

炎癥性腸病(inflammatory bowel diseases,IBD)是一種慢性炎性、特發性和復發性的胃腸道疾病。臨床上，IBD主要包括克羅恩病(Crohn’s disease,CD)和潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)。雖然引起IBD的具體機制尚不十分清楚，但有人認為免疫、遺傳和環境因素可能在疾病發病中起到很重要的作用[1]。在生理條件下，腸道共生菌群定植于胃腸道，對腸道黏膜屏障、代謝和免疫調節等功能發揮積極作用，同時一些病原微生物也能潛伏在腸道，對腸道構成一定威脅，因此，消化系統能夠平衡共生菌和病原菌的免疫反應，以保持腸道穩態[2]。最近有文獻報道，腸道菌群失調可以誘導腸道免疫應答的失調，最終導致腸炎的發生[3]。牛初乳(bovine colostrum,BC)是一種富含多種抗菌肽、生長因子和免疫調節因子的牛奶，對胃腸道的功能有著重要的保護作用[4]。牛初乳的功能主要體現在：提供必需的營養成分，加強自然防御系統，調節腸道菌群和免疫反應，促進組織的生長、成熟和修復[5]。牛初乳和牛初乳衍生產品已被用于預防和治療多種胃腸道疾病[6]，但其具體調節機制尚不十分清楚。為了驗證“牛初乳通過調節腸道菌群改善小鼠潰瘍性結腸炎”這一推測，本研究擬用葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)構建C57BL/6J小鼠腸炎模型，監測其體重和腸炎評分的變化，同時應用HE染色及結腸組織病理評分觀察牛初乳對小鼠腸炎的影響；實時熒光定量多聚核苷酸鏈式反應(real-time quantitative polymerase chain reaction,QPCR)監測腸道菌群中常見微生物的含量，初步探討牛初乳抗潰瘍性結腸炎的可能分子機制。該項目的完成可為腸炎的防治提供新的思路和手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與試劑

所有C57BL/6J小鼠均購于南京君科生物工程有限公司，牛初乳購自Qiagen公司，DSS購于美國MPBio公司，DNA提取試劑盒購于Qiagen公司，SYBR Green PCR試劑盒購于美國ABI公司，引物由上海生工合成。

1.2 實驗方法

1.2.1 建立腸炎模型 將20只5～6周齡雌性C57BL/6J小鼠隨機分為四組，即對照組(5只)、BC組(5只)、2%DSS組(5只)和BC+2%DSS組(5只)。BC組、BC+DSS組通過灌胃法每天接受含有牛初乳的懸浮液(牛初乳飼養量0.23 mg/g體重)，對照組、DSS組小鼠接受等體積的0.9%鹽水溶液，持續21天。按照參考文獻[7]的方法建立小鼠潰瘍性結腸炎模型，即將葡聚糖硫酸鈉(DSS，分子量為36 000～50 000)溶于蒸餾水中，配制成2%的DSS溶液；從牛初乳灌胃21天后開始連續給予DSS組、BC+DSS組小鼠7天2%DSS自由飲水，即可建立小鼠潰瘍性結腸炎模型。

1.2.2 稱重 從給予DSS前一天(D0)開始每天固定時間稱量各組小鼠體重，以D0的體重為基數。

1.2.3 腸炎疾病活動指數(disease activity index,DAI)評估 從給予DSS前一天開始每天固定時間觀察小鼠體重、糞便性狀和便血情況，按照以下標準對小鼠進行評分，將小鼠體重、糞便性狀和便血情況的評分相加即小鼠的DAI分值，以評估腸炎疾病的嚴重程度。評分標準如下：(1)體重改變評分標準(0～4分)：小鼠體重下降0%～1%被評為0分；下降1%～5%被評為1分；下降5%～10%被評為2分；下降10%～20%被評為3分；下降20%以上被評為4分。(2)糞便性狀評分標準(0～4分)：正常糞便0分；軟便1分；稀便2分；腹瀉4分。(3)血便評分標準(0～4分)：正常糞便0分；糞便表面有血跡2分；嚴重出血4分。將以上3個分數相加即DAI的分值。

1.2.4 HE染色和結腸組織病理學評分(Histopathological score,HS) 取結腸組織并去除腸內容物后置于10%中性甲醛溶液中固定，循著包埋(石蠟)-切片-染色(HE)-脫水(酒精)-逐級脫水-透明(二甲苯)-封片(中性樹膠)的步驟，最后在光鏡下觀察腸道黏膜充血、上皮細胞脫落壞死及炎癥細胞浸潤等病理變化，并按如下標準進行結腸組織病理評分：(1)潰瘍評分標準(0～2分)：小鼠結腸組織中無潰瘍被評為0分；有小潰瘍(<3 mm)被評為1分；有大潰瘍(>3 mm)被評為2分。(2)炎癥評分標準(0～2分)：無炎癥0分；輕度炎癥1分；重度炎癥2分。(3)肉芽腫評分標準(0～1分)：無肉芽腫0分；有肉芽腫1分。(4)病變深度評分標準(0～3分)：無病變0分；有病變且至黏膜下層1分；有病變且至肌層2分；有病變且至漿膜層3分。(5)纖維化評分標準(0～2分)：無纖維化0分；輕度纖維化1分；重度纖維化2分。將以上5個分數相加即病理學評分分值。

1.2.5 QPCR檢測 實驗結束后，按照Qiagen公司的DNA提取試劑盒提取糞便中的DNA,通過QPCR監測小鼠糞便中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的DNA含量(引物[8-10]見表1)。QPCR反應體系：2×QPCR Mix 5.0 μL，引物工作液(2.5 μmol/L)0.8 μL，探針0.2 μL，DNA模版2.0 μL，ddH2O 2.0 μL，總體積10 μL，每個樣本均做3復孔，QPCR擴增條件：95 ℃預變性1 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環。

表1 大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌的基因引物

1.3 統計學處理

實驗數據以均數±標準差表示，運用SPSS 17.0軟件進行統計分析，均數之間的比較采用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 牛初乳抑制DSS誘導的腸炎小鼠體重下降

對照組和BC組小鼠的體重平穩上升，兩組差異無顯著性(P>0.05)；DSS組小鼠的體重在第3天(D3)后呈現顯著性降低的趨勢，與對照組相比差異有顯著性且差異持續增大，在第10天(D10)下降到最低值，體重下降了約23.5%；BC+DSS組小鼠的體重也在D3后呈現顯著性降低的趨勢，但在第8天(D8)下降到最低值，下降了約15%，并在之后的幾天里體重呈現顯著性增加的趨勢，在第11天(D11)時接近給予DSS前一天時的體重。與DSS組比較，BC+DSS組在D8出現顯著性差異且差異持續增大(P<0.01)；而與對照組相比，BC+DSS組在D8后差異顯著性降低(P<0.01)。結果顯示：牛初乳能抑制DSS誘導的腸炎小鼠體重下降(圖1)。

圖1 牛初乳對DSS誘導的腸炎小鼠體重的影響與DSS組比較，*P<0.01(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

2.2 牛初乳降低DSS誘導的小鼠腸炎疾病評分

對照組和BC組小鼠沒有發生腸炎，其疾病評分始終為0分；DSS組小鼠從給予DSS后第二天起腸炎評分不斷上升，在第7天達到峰值約2.5分后有所下降并趨于穩定；BC+DSS組從第3天起小鼠腸炎評分不斷上升，在第7天達到峰值2.3分，但從第8開始，小鼠腸炎評分呈顯著性下降到接近對照組水平。結果顯示(圖2)：牛初乳降低DSS誘導的小鼠腸炎疾病評分。

圖2 牛初乳對DSS誘導的小鼠腸炎疾病評分的影響與DSS組比較，*P<0.01(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

2.3 牛初乳修復DSS誘導的小鼠結腸組織損傷

小鼠牛初乳灌胃21天后，給予2%DSS飲水，持續7天，HE染色結果顯示(圖3)：對照組和BC組小鼠結腸各層結構清晰，黏膜層腸腺豐富，排列規則，黏膜下層以及肌層未見明顯異常；DSS組小鼠局部腸柱狀上皮細胞點狀壞死，胞核固縮深染(黑色箭頭)，固有層腸腺減少消失，被肉芽組織取代，并伴有較多炎性細胞浸潤(紅色箭頭)，中性粒細胞為主，損傷侵及黏膜下層，黏膜下層中也可見少量炎性細胞(黃色箭頭)；BC+DSS組小鼠結腸組織結構基本完整，黏膜層中偶見小灶性的炎性細胞浸潤，其余未見明顯改變。結腸組織病理學評分結果(圖4)：對照組和BC組均為0；DSS組[(6.05±1.03)分]與BC+DSS組[(1.33±0.54)分]比較，差異有顯著性，P<0.01。牛初乳能顯著性減輕DSS誘導的小鼠結腸炎癥反應。

2.4 牛初乳改善DSS誘導的小鼠腸道菌群失調

實驗結束后通過QPCR檢測小鼠糞便中大腸桿菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌的DNA含量變化，結果顯示(圖5)：BC組小鼠腸道內大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌含量與對照組比較，差異無顯著性(P>0.05)；DSS組小鼠腸道內大腸桿菌含量較對照組顯著性增加，而雙歧桿菌和乳酸桿菌含量顯著性減少(P<0.01)；BC預處理后再用DSS誘導的小鼠(即BC+DSS組)大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌含量與DSS組比較，均顯著性恢復，接近對照組及BC組的水平。牛初乳改善DSS誘導的小鼠腸道菌群失調。

3 討 論

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis,UC)是一種非特異性炎癥性疾病，屬于炎癥性腸病的一種。病變部位多為乙狀結腸和直腸，也可延伸至結腸，嚴重者蔓延到整個結腸。該病病程長，反復發作，若得不到及時的治療，長期發展下去極易發生癌變[11]。調查發現，近年來其發病率逐年上升，雖然免疫抑制劑能在一定程度上控制部分患者的病情，但其價格昂貴且副作用強[12]。因此研究其發病與防治機制并尋找新的治療手段是該病領域中急需解決的問題。

圖3 牛初乳對DSS誘導的小鼠結腸炎癥反應的影響(10×,HE)(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

圖4 牛初乳對DSS誘導的小鼠腸道組織病理學評分的影響與DSS組比較，*P<0.01(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

圖5 牛初乳對DSS誘導的小鼠腸道內大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的影響與DSS組比較，*P<0.01(注：BC為牛初乳；DSS為葡聚糖硫酸鈉)

引起UC的致病因素極其復雜，至今尚不十分清楚。文獻報道UC的發病可能與腸道菌群的異常反應、疾病進程中的環境因素以及遺傳學傾向有關。正常情況下保護性免疫和腸道菌群之間的相互作用使腸道處于穩定平衡狀態，即腸道穩態。各種原因引起的腸道菌群結構和功能變化(腸道菌群失調)，是導致腸道穩態被打破的重要原因之一，該穩態一旦被打破，會導致腸道功能失調，從而形成腸炎。Nishino K等人[13]證實，腸炎患者的腸道菌群失調，腸道內變形菌門細菌較正常人顯著增多，但厚壁菌門和擬桿菌門細菌顯著減少。

牛初乳(bovine colostrum,BC)是一種純天然食品，是指在牛分娩一周內所產生的乳汁。牛初乳較普通乳汁除了能夠提供更高含量的營養化學物質外，還含有許多特殊的生物活性成分，如免疫球蛋白、乳鐵蛋白、乳過氧化物酶、生長因子、激素、細胞因子、脯氨酸多肽、溶菌酶等，這些生物活性物質是牛初乳的精華所在。牛初乳作為一種免疫調節劑，可減輕腹瀉[14]，改善小鼠結腸炎[15]。口服牛初乳粉溶液，可以降低巨結腸大鼠模型發生腸炎的概率，且對巨結腸大鼠有預防腸炎發生的作用；牛初乳還可通過修復腸上皮損傷，降低炎癥細胞因子和一氧化氮的表達，從而逆轉慢性結腸炎[16]。且Filipescu IE等人[17]研究證實，BC給藥耐受性良好，并不會引起健康小鼠體重的降低、腸炎疾病評分、腸組織炎性的損傷及腸道微生物的變化，因此可以確定BC的安全性和本實驗結果的有效性。本研究前期結果發現牛初乳能夠治療小鼠潰瘍性結腸炎，對DSS誘導的腸炎小鼠體重降低、腸炎疾病評分、腸組織炎性損傷等有顯著性的修復改善作用，這與文獻報道完全一致，證實了牛初乳可保護腸道、減輕腸道炎癥程度。為了進一步探究牛初乳對小鼠潰瘍性結腸炎的改善作用是否與調節腸道菌群有關，本課題組通過QPCR檢測了腸道菌群中大腸桿菌、雙歧桿菌和乳酸桿菌的含量。結果發現：DSS組(與對照組比較)小鼠腸道內大腸桿菌含量顯著性增加，雙歧桿菌和乳酸桿菌含量顯著性減少；BC+DSS組(與DSS組比較)大腸桿菌、乳酸桿菌和雙歧桿菌含量均顯著性恢復，幾乎接近對照組的水平。這證實牛初乳對小鼠潰瘍性結腸炎的改善作用與調節腸道菌群有關。

綜上所述，牛初乳對小鼠潰瘍性結腸炎有一定的改善作用，其改善作用可能與腸道菌群有關，但由于牛初乳成分復雜，對小鼠潰瘍性結腸炎的作用是多方面的，可能包括調節免疫應答、增強黏膜屏障功能等方面，目前尚不能用單一理論解釋牛初乳對小鼠潰瘍性結腸炎的作用機制，這還有待進一步研究及探討。