金絲桃苷對糖尿病心肌損傷保護作用研究

劉兆祥，袁 宇，趙文婷，胡麗萍

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué) 研究生學(xué)院，遼寧 沈陽 110847)

糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是由糖代謝紊亂觸發(fā)心肌細胞學(xué)改變，導(dǎo)致亞臨床心功能異常，并逐漸進展為心肌小血管病變、微循環(huán)障礙及心臟結(jié)構(gòu)改變和心臟功能異常的疾病[1]。作為糖尿病(Diabetes mellitus，DM)狀態(tài)下一種獨立的心血管病變，該病最終可演變?yōu)槌溲孕牧λソ撸踔烈l(fā)猝死，是DM患者死亡的主要原因之一。糖尿病心肌病最初被描述為糖尿病患者除高血壓、冠心病、瓣膜性疾病及先天性心臟病等存在的情況下發(fā)生的心力衰竭，其概念由Rubler等在1972年首次提出[2]，他們發(fā)現(xiàn)在沒有主要冠狀動脈疾病的情況下，糖尿病患者出現(xiàn)了心源性增大和充血性心力衰竭。可見糖尿病可獨立于其他致病因素，如冠狀動脈疾病和高血壓，直接影響心臟結(jié)構(gòu)和功能誘發(fā)DCM，最終導(dǎo)致心力衰竭，并增加死亡率。該病早期以左室舒張功能異常為主，晚期則表現(xiàn)為左室收縮功能障礙，最終可引起心肌廣泛灶性壞死，其主要病理改變包括心肌細胞外基質(zhì)堆積，心肌肥厚及心肌間質(zhì)纖維化[3-6]。

金絲桃苷又名槲皮素-3-O-β-D吡喃半乳糖苷，屬于黃酮醇苷類化合物，是一種重要的天然產(chǎn)物[7]，廣泛分布于各種植物中的果實與全草中。臨床上含有金絲桃苷的藥物有很多，大多為治療心血管疾病的藥物，除此之外金絲桃苷還具有抗炎、抗衰老、抗腫瘤[8]、抗抑郁、保肝、免疫調(diào)節(jié)[9]等多種作用。本實驗研究金絲桃苷對高脂飲食結(jié)合小劑量鏈脲佐菌素(STZ)誘導(dǎo)的2型糖尿病小鼠心肌病變的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與儀器

1.1 材料與試劑

C57BL/6J雄性小鼠(遼寧長生生物技術(shù)有限公司)；金絲桃苷(HyP)(沈陽康派特生物科技有限公司，純度98%)；辛伐他汀(每片20 mg，杭州默沙東制藥有限公司)；高脂飼料(沈陽市于洪區(qū)前民動物實驗飼料廠)；鏈脲佐菌素STZ(美國Sigma Aldrich公司)；ELISA試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)；Masson染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)；異氟烷(深圳瑞沃德生命科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備

石蠟切片機(德國Leica公司)；酶標儀(美國Biotek公司)；高速冷凍離心機(德國eppendorf公司)；生物組織包埋機，烤片機(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)；上海ATP700(ST)電腦全自動脫水機；血糖儀及試紙條(美國羅氏公司)；彩色多普勒超聲心動圖儀HP7500(美國惠普公司)；光學(xué)顯微鏡(日本尼康Nikon公司)。

2 實驗方法

2.1 動物模型的構(gòu)建

5～6周齡C57BL/6J雄性小鼠50只適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，正常組以普通飼料喂養(yǎng)；模型組以高脂飼料喂養(yǎng)4周，禁食不禁水約12 h，以100 mg/kg的劑量腹腔注射鏈脲佐菌素STZ，正常組小鼠腹腔注射等體積檸檬酸緩沖液，期間密切監(jiān)測小鼠體重、血糖、尿液、攝食量、攝水量、毛發(fā)等變化。分別于造模實驗開始后0周、6周、11周、16周、18周，禁食不禁水約12 h后稱重。取鼠尾血用血糖儀測量空腹血糖值(FBG)，以空腹血糖值>13.89 mmol/L認為2型糖尿病小鼠造模成功[10-13]。

2.2 超聲心動圖檢測小鼠心功能

小鼠用異氟烷吸入麻醉，采用超聲檢測儀檢測射血分數(shù)(EF)、短軸縮短距(FS)、心率(HR)、心輸出量(CO)、舒張期左心室內(nèi)徑(LVIDd)、收縮期左心室內(nèi)徑(LVIDs)、舒張期左室后壁厚度(LVPWd)、收縮期左室后壁厚度(LVPWs)、A峰與E峰之比(E/A)等。待檢測到模型組小鼠射血分數(shù)(EF)、短軸縮短距(FS)值降低，左室內(nèi)徑增加，說明糖尿病心肌病小鼠造模成功[14]。

2.3 小鼠血清指標檢測

干預(yù)8周后，摘取各組小鼠眼球血，高速冷凍離心機4 ℃離心取血清，生化法檢測各組小鼠血清中總膽固醇(TC)、甘油三酯(TG)、血糖(GLU)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量。ELISA法檢測小鼠血清中肌鈣蛋白I、SOD、MDA含量。

2.4 心肌組織形態(tài)觀察

取小鼠心肌組織，放入多聚甲醛溶液中進行固定后制備石蠟切片并進行HE染色，放置顯微鏡下觀察心臟組織的病理變化。Masson染色觀察心肌組織纖維化情況。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS25.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗進行比較，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組小鼠狀態(tài)比較

實驗共選用 40只C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ造模，在造模后72 h內(nèi)死亡2只，剩余38只小鼠72 h后檢測空腹血糖，共有34只小鼠空腹血糖高于13.89 mmol/L，糖尿病小鼠造模成功。

對照組小鼠在整個實驗周期中狀態(tài)良好，進食正常，體毛順滑富有光澤。模型組小鼠前4周狀態(tài)良好，體質(zhì)量增加明顯，注射STZ后質(zhì)量迅速下降，進食量飲水量尿量顯著增多，體毛量稀疏光澤度降低，反應(yīng)遲緩活動量降低。與模型組小鼠對比，金絲桃苷組、辛伐他汀組小鼠的上述表現(xiàn)均不同程度減輕。于第16周，從每個實驗組隨機抽取8只小鼠進行心功能檢測、血清胰島素水平檢測、組織學(xué)觀察等。造模第16周，HFD+STZ組小鼠出現(xiàn)心室功能障礙，心肌細胞肥大，心肌纖維化。

3.2 超聲心動圖檢測小鼠心功能

超聲心動圖結(jié)果如圖1、表1所示，通過超聲心動圖檢測顯示，模型組小鼠心率減慢，短軸向縮短距(FS)和射血分數(shù)(EF)均有不同程度的降低，舒張期和收縮期左室內(nèi)徑(LVIDd)增加。結(jié)合生化檢測儀分析血清肌酸激酶CK，乳酸脫氫酶LDH值異常升高，ELISA檢測肌鈣蛋白I含量增高，證明模型組小鼠心肌損傷存在，糖尿病心肌病(DCM)小鼠造模成功。由表1可知，與正常組比較，模型組EF、FS值顯著降低(P<0.01)。HyP組與辛伐他汀組均可增加EF、FS值，其中辛伐他汀組效果優(yōu)于HyP組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。

注：A為正常組，B為模型組，C為HyP組，D為辛伐他汀組。

表1 各組小鼠EF、FS比較

3.3 小鼠血清指標檢測

血清指標檢測結(jié)果如表2、表3、表4所示。與正常組相比，模型組小鼠的血糖(GLU)、乳酸脫氫酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、高密度脂蛋白(HDL)、低密度脂蛋白(LDL)含量水平均顯著升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，TC值升高約162%，說明模型組小鼠血清中各生化指標嚴重紊亂，小鼠糖脂代謝紊亂，伴隨出現(xiàn)進食量、進水量、尿量升高但體重減輕的明顯三多一少癥狀，證明糖尿病小鼠造模成功。給藥后各組指標出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)，說明HyP組與辛伐他汀組具有保護心臟、改善糖脂代謝、調(diào)節(jié)小鼠血清TC、TG紊亂的作用。

表2 各組小鼠TC、TG、GLU含量比較

表3 各組小鼠HDL、LDL含量比較

表4 各組小鼠LDH、CK含量比較

3.4 小鼠血清ELISA檢測結(jié)果

干預(yù)8周后，摘取各組小鼠眼球血，采用ELISA試劑盒檢測各組小鼠血清中肌鈣蛋白I、SOD、MDA含量。結(jié)果如下，由圖2、圖3、圖4可知，與正常組相比，模型組小鼠SOD活力顯著降低(P<0.05)，SOD是重要的抗氧化酶，可消除機體代謝過程中產(chǎn)生的有害物質(zhì)。模型組中SOD活性顯著降低，說明糖尿病小鼠的抗氧化能力減弱。給藥后HyP組與辛伐他汀組SOD含量均明顯升高(P<0.05)，說明HyP與辛伐他汀具有提高糖尿病小鼠抗氧化能力的作用；與正常組相比，模型組小鼠肌鈣蛋白與MDA含量均顯著增多(P<0.01)，MDA是反映脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的重要指標，模型組小鼠MDA含量增加說明糖尿病小鼠脂質(zhì)過氧化反應(yīng)升高。給藥后，HyP組和辛伐他汀組的MDA含量均降低，說明HyP和辛伐他汀能緩解脂質(zhì)過氧化反應(yīng)。肌鈣蛋白I是一類高特異性的心肌損傷壞死的標志物。與正常組相比，模型組小鼠肌鈣蛋白I含量顯著升高(P<0.05)，提示糖尿病小鼠心肌已出現(xiàn)損傷，給藥后，HyP組與辛伐他汀組肌鈣蛋白I含量均降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，說明HyP和辛伐他汀具有保護糖尿病小鼠心肌的作用。

圖2 各組小鼠肌鈣蛋白I含量的變化

注：與正常組相比，**P<0.01，*P<0.05；與模型組相比，##P<0.01，#P<0.05(n=8)。

圖4 各組小鼠MDA含量的變化

3.5 心肌組織形態(tài)觀察

取小鼠心肌組織，制備石蠟切片并進行病理研究，心臟組織HE染色結(jié)果如圖5所示，Masson染色觀察心肌組織纖維化結(jié)果如圖6所示。由圖5可知，正常組小鼠心肌細胞排列整齊，心肌細胞形態(tài)正常，細胞連接清晰染色均勻，細胞核呈卵圓形，細胞間界限清晰核明顯，核呈藍紫色，無腫脹壞死。與正常組相比，模型組小鼠心肌細胞排列紊亂，心肌細胞出現(xiàn)核裂解以及核丟失情況，細胞邊界不清肥大壞死。給藥干預(yù)后明顯改善，腫脹壞死細胞數(shù)量明顯減少，說明HyP與辛伐他汀對糖尿病小鼠心肌組織起到了保護作用。

注：A為正常組，B為模型組，C為中藥組，D為西藥組。

由圖6可看出，光鏡下觀察小鼠心肌膠原纖維呈藍紫色，小鼠心肌細胞核呈深藍色。與正常組比較，模型組小鼠左心室心肌組織存在心肌纖維化，心肌膠原纖維增多，心肌細胞間隙增加，影響心肌收縮舒張功能。正常組小鼠心肌間質(zhì)和血管周圍均勻出現(xiàn)少量膠原纖維，模型組小鼠心肌間質(zhì)和血管周圍膠原纖維增多且排列紊亂，HyP組和辛伐他汀組小鼠心肌間質(zhì)膠原纖維較模型組有效減少，對糖尿病小鼠心肌具有保護作用。

注：A為正常組，B為模型組，C為HyP組，D為辛伐他汀組。

4 討論

根據(jù)國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)2017年統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國20～79歲人群中糖尿病患者有1.144億，居世界首位，其中2型糖尿病占我國糖尿病患者的95%以上，病因包括胰島素抵抗、胰島素進行性分泌不足，或兩者兼有。糖尿病患者長期處于高糖環(huán)境下，可直接促進心肌細胞蛋白的合成，進而誘發(fā)心肌細胞肥大，導(dǎo)致心臟舒張期延長以及收縮力下降，進而發(fā)展為糖尿病心肌病[15]。糖尿病心肌病的發(fā)病機制較為復(fù)雜，臨床上常表現(xiàn)為不同程度的左室收縮和舒張功能不全，其中舒張功能受損常出現(xiàn)于收縮功能受損之前[16]，也可伴有心律失常，心源性休克甚至猝死。肌鈣蛋白I、CK、CK-MB作為心臟損傷標志物，結(jié)合超聲心動圖和病理結(jié)果以及糖尿病小鼠造模條件，共同確定糖尿病引發(fā)了心肌損傷。SOD作為一種重要的抗氧化酶，能抑制心腦血管疾病抗衰老抗氧化，對糖尿病有明顯的恢復(fù)作用。MDA是膜脂過氧化的終產(chǎn)物之一。

本研究通過高脂飲食聯(lián)合腹腔注射STZ誘導(dǎo)的C57BL/6J小鼠DCM模型，腹腔注射STZ 1周后，小鼠空腹血糖值均持續(xù)高于13.89mmol/L，說明小鼠已經(jīng)產(chǎn)生了胰島素抵抗和胰島功能受損，證實已成功建立2型糖尿病小鼠模型。實驗結(jié)果表明，金絲桃苷能降低糖尿病小鼠空腹血糖，降低肌鈣蛋白I、MDA含量，增加SOD含量，提高射血分數(shù)EF、短軸縮短距FS值，從而改善心肌功能，對糖尿病引起的心肌損傷具有保護作用。