HPLC法測定尿石清合劑中夏佛塔苷的含量

楊素紅，胡玉良

(廣州中醫藥大學附屬中山中醫院，廣東 中山 528400)

尿石清合劑是廣東省中山市中醫院自主研發的制劑，具有通淋排石、清熱利濕、消水腫解血毒的功效[1]。通過對制劑處方中廣金錢草的主要有效成分夏佛塔苷的含量測定進行方法學研究，認為該方法簡單快捷、重現性好、結果準確可靠[2-3]，現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜(安捷倫科技有限公司)；BS224S電子分析天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司d=0.000 1 g)；UV-2550PC系紫外-可見分光光度計(島津儀器(蘇州)有限公司)；SHZ-D(III)循環水式多用真空泵(上海予華儀器設備有限公司).

1.2 試藥

夏佛塔苷對照品(批號：X-029-180412，規格：20 mg，成都瑞芬思生物科技有限公司)；甲醇、乙腈為色譜純；水為重蒸餾水；其余試劑為分析純。所用藥材均購于廣州康圣藥業有限公司；尿石清合劑(廣東省中山市中醫院)。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Eclipse XDB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相乙腈-水(12∶88)，檢測波長220 nm；柱溫30 ℃；流速1.0 mL/min；進樣量20 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 精密稱取夏佛塔苷對照品0.010 3 g至100 mL棕色量瓶中，用50%甲醇定容，即得。

2.2.2 供試品溶液制備 精密量取尿石清合劑(批號：20190218)5 mL至20 mL量瓶中，用50%甲醇定容，靜置4 h后，用一次性注射器吸取，經微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液制備 按尿石清合劑處方比例，制備缺廣金錢草藥材的陰性試劑，取各藥材，加水700 mL，煎煮至濾液為100 mL，取2 mL加入100 mL棕色量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，靜置4 h后，用一次性注射器吸取，經微孔濾膜濾過，取濾液，即得陰性溶液。

2.2.4 藥材溶液制備 用電子天平稱取30 g廣金錢草藥材，第一次加水350 mL，先用水浸泡0.5 h，之后煎煮，過濾取濾液，第二次加水300 mL煎煮，取濾液，兩次濾液合并后為100 mL，取10 mL加入100 mL棕色量瓶中，用50%甲醇定容，靜置4 h后，用一次性注射器吸取，經微孔濾膜濾過，取濾液，即得藥材溶液。

2.3 方法學實驗[4]

2.3.1 專屬性考察 取對照品溶液，按上述擬定色譜條件進樣測定，記錄圖譜，結果見圖1，夏佛塔苷的色譜峰能達到基線分離，計算得夏佛塔苷的理論塔板數>1 000，保留時間在27.0 min。

圖1 對照品溶液高效液相色譜

取供試品溶液，按上述擬定色譜條件進樣測定，記錄色譜，結果見圖2，計算得夏佛塔苷的理論塔板數>1 000，分離度>1.5，保留時間為27.7 min。

圖2 供試品溶液高效液相色譜

取陰性溶液，按上述擬定色譜條件進樣測定，記錄色譜，結果見圖3，陰性溶液在與對照品及供試品溶液相同保留時間處未顯色譜峰，表明專屬性良好。

圖3 陰性溶液高效液相色譜

取藥材溶液，按上述擬定色譜條件進樣測定，記錄色譜，結果見圖4，計算得夏佛塔苷的理論塔板數>1 000，分離度>1.5，保留時間為26.3 min。

2.3.2 線性關系考察 精密稱取對照品0.020 6 g至50 mL量瓶中，得到0.412 μg/μL的對照品溶液，從量瓶中繼續吸取25 mL溶液至另一50 mL量瓶中，如此逐級稀釋4次，得到的對照品溶液濃度分別為0.025 75 μg/μL、0.051 5 μg/μL、0.103 μg/μL、0.206 μg/μL和0.412 μg/μL。按所擬定色譜條件進樣測定，記錄夏佛塔苷峰面積，以濃度X(μg/mL)為橫坐標，峰面積Y為縱坐標，進行線性回歸，得到其濃度和峰面積的線性回歸方程為：Y=15.88X+23.75(R2=0.999 8，n=5)。結果表明，夏佛塔苷濃度在26～412 μg/mL之間線性關系良好。

2.3.3 精密度試驗 取“2.2.1”項下對照品溶液，按所擬定色譜條件連續進樣6次，測定色譜峰面積，計算RSD值為0.62%(n=6)，表明儀器精密度良好。

圖4 藥材溶液高效液相色譜

2.3.4 穩定性試驗 取同一份供試品(批號：20190218)適量，分別于室溫下放置0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，按所擬定色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算RSD為0.55%(n=6)，表明供試品在室溫下24 h內穩定性良好。

2.3.5 重復性試驗 取尿石清合劑(批號：20190218)，按供試品制備項下的方法平行制備6份供試品，按所擬定色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算RSD為0.73%(n=6)，表明該方法的重復性良好。

2.3.6 樣品加樣回收試驗 精密量取已知含量的樣品(批號：20190218)9份，每份2 mL，置20 mL量瓶中，分別加入濃度為0.103 mg/mL的對照品溶液5 mL、10 mL、15 mL各3份，按供試品制備方法平行制備9份待測溶液，按所擬定色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算加樣回收率。結果見表1，樣品的平均回收率為96.85%(RSD=1.01%，n=9)，表明該方法的回收率良好。

表1 加樣回收率試驗結果

2.3.7 樣品含量測定 取6批尿石清合劑，每批平行制備2份，按供試品制備方法制備12份供試品，按所擬定色譜條件進樣測定，記錄峰面積，并用回歸方程計算含量。結果見表2，結果顯示，不同的批號含量有差異，可能與夏佛塔苷的不穩定性質有關，時間越近，含量越高，總平均含量為560.9 μg/mL。

表2 樣品含量測定結果 (μg/mL)

3 討論

《中國藥典》中夏佛塔苷的HPLC流動相選擇為甲醇-水(32∶68)，以上經過檢測發現，峰形都不好，乙腈-水(15∶85)，對照品峰形可以，但供試品峰形不好，與別的峰連在一起，和別的峰分不開，分離效果差。后改用乙腈-水(12∶88)，對照品和供試品峰形都可以，保留時間大約在27min左右。故本實驗最后采用乙腈-水(12∶88)的方法來洗脫出夏佛塔苷目標峰。

根據上述各項測定結果，用HPLC法測定尿石清合劑中的君藥廣金錢草所含有的主要有效成分夏佛塔苷的含量測定結果準確可靠，且分析方法操作簡便、快捷、重現性好、靈敏度高，對制定尿石清合劑中夏佛塔苷含量限度的指標及尿石清合劑的質量標準、質量監控以及質量開發研究都具有一定的指導意義。