核桃國(guó)內(nèi)外主栽品種種質(zhì)資源搜集及DNA提取保存

王晶 李建 史根生

摘 要：本研究搜集了211個(gè)國(guó)內(nèi)外核桃主栽品種，采集了核桃品種的枝條，并對(duì)采集的品種枝條的芽進(jìn)行嫁接，試驗(yàn)在山西省農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)作物研究所核桃資源圃內(nèi)進(jìn)行，建立引種檔案。取當(dāng)年新生枝條的頂端嫩葉，進(jìn)行核桃品種DNA的提取，并于山西省農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝實(shí)驗(yàn)室-80℃冰箱內(nèi)保存。

關(guān)鍵詞：核桃;引種;DNA提取

中圖分類號(hào)：S-3 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

DOI：10.19754/j.nyyjs.20200930010

核桃（Juglans regia L.）屬胡桃科核桃屬，是核桃屬中栽培最為廣泛的種。核桃是一種果材兼用的落葉樹(shù)種，在我國(guó)核桃的栽培歷史悠久，種植資源豐富，形成了眾多特異優(yōu)良的地方品種。我國(guó)核桃的分布很廣，遼寧、天津、北京、河北、山東、山西、陜西、寧夏、青海、甘肅、新疆、河南、安徽、江蘇、湖北、湖南、廣西、四川、貴州、云南及西藏等21個(gè)省份都有分布。

核桃是重要的堅(jiān)果和木本糧油樹(shù)種，位列世界4大干果（核桃、扁桃、腰果和榛子）之首。核桃被醫(yī)學(xué)界公認(rèn)為抗衰老食品，并素有“長(zhǎng)壽果”的美譽(yù)。核桃仁中富含蛋白質(zhì)、脂肪、纖維素、維生素等營(yíng)養(yǎng)元素，含有最適宜人體健康的ω-3脂肪酸、褪黑激素、生育酚和抗氧化劑等，可有效減緩和預(yù)防心臟病、癌癥、動(dòng)脈疾病、糖尿病、高血壓、肥胖癥和臨床抑郁癥的發(fā)生。

地方品種是在特定地區(qū)經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期栽培和自然選擇而形成的品種，對(duì)所在地區(qū)氣候和生產(chǎn)條件一般具有較強(qiáng)適應(yīng)性，并含有豐富的基因型，具有豐富的遺傳多樣性，常存在特殊優(yōu)異的性狀基因，是果樹(shù)品種改良的重要基礎(chǔ)和優(yōu)良基因來(lái)源。所以，搜集地方核桃品種資源是非常有意義的。

1 核桃品種的枝條采集及保存

1.1 枝條采集

在山西省、東北省、山東省、河南省、陜西省、河北省等核桃主要種植省份，采集了211個(gè)品種，具體采集信息見(jiàn)表1。將采集的品種枝條用濕布包裹運(yùn)回基地，嫁接于優(yōu)質(zhì)的實(shí)生核桃品種上。

1.2 嫁接

于2020年6月，選擇長(zhǎng)勢(shì)良好的實(shí)生核桃樹(shù)木，將引入的核桃品種芽嫁接，保存品種。

1.2.1 選砧木

選用生長(zhǎng)旺盛、無(wú)病蟲(chóng)害的1～2a的實(shí)生苗，要求距地面5～6cm處的直徑在0.5cm以上。芽接前10d左右，將選定的砧木下部距地面7～8cm以上的分枝剪去，以便于操作。

1.2.2 選削接穗

選要取樣品種健壯、豐產(chǎn)、無(wú)病蟲(chóng)害的中年核桃樹(shù)冠外圍部位，選取葉芽飽滿的當(dāng)年生發(fā)育枝。選好枝條后，剪除葉片，只留葉柄。左手拿好枝條，右手持芽接刀，先在枝條上選定1個(gè)芽，在選定的葉芽上方0.5cm處橫切1刀，然后用刀自下端橫切處緊貼枝條的木質(zhì)部向上削去，一直削到上端橫切處，削成1個(gè)上寬下窄的盾形芽片接穗。為了保持接穗的濕度，可將接穗含在口里或用濕布蓋好。

1.2.3 切砧木

在砧木的北邊距枝底2～3cm處橫切1刀，長(zhǎng)約1cm，深度以切斷砧木皮層為度，再?gòu)臋M口中間向下垂直切1刀，長(zhǎng)約1～1.2cm，切成T形。然后用芽接刀骨柄挑開(kāi)砧木皮層，以便插進(jìn)接穗。

1.2.4 插接穗

用芽接刀挑開(kāi)砧木上的T字形切口，將接穗插入切口中，插入時(shí)接穗的葉柄要朝上。插入后，要使接穗上端同T字形橫切口對(duì)齊，如果接穗過(guò)長(zhǎng)，可自上端切去一些。

1.2.5 綁縛

用塑料袋或其它綁縛材料，先從接口上邊綁起，逐漸往下纏，葉芽和葉柄要留在外邊。

1.2.6 接后管理

接后3～4d要檢查嫁接是否成活。如果接穗的葉柄用手輕輕一碰立即脫落，接穗皮色鮮綠，說(shuō)明已經(jīng)接活;如果葉柄不落，接穗干枯，即沒(méi)有接活，需要補(bǔ)接。成活10d后，要將綁縛解除，以免阻礙結(jié)合部位生長(zhǎng)。在此以后，要進(jìn)行剪貼。夏季接的要在當(dāng)年剪砧。剪砧的位置是在T字形橫口上方2cm左右。當(dāng)接穗萌發(fā)長(zhǎng)到一定高度時(shí)，應(yīng)在一旁插1個(gè)支柱，將接穗枝條綁縛在支柱上，使接穗枝條直立生長(zhǎng)，并可防止被風(fēng)吹折。

1.3 建立引種檔案

用卡片登記核桃品種的詳細(xì)農(nóng)藝特性，并裝訂成冊(cè)，建立引種檔案。

2 核桃品種的DNA提取及保存

2.1 核桃品種DNA提取

剪取0.2～0.3g新鮮葉片于2mL離心管中（剛好淹沒(méi)管底），迅速放入液氮罐中，在管蓋及管壁上標(biāo)注好樣品名稱。采樣結(jié)束回到實(shí)驗(yàn)室后，用鑷子將2mL離心管夾出，向管內(nèi)加入3mm鋼珠2粒，再次放入液氮桶中。將2mL離心管置入430組織破碎儀樣品板中，液氮澆在樣品板上，使樣品保持速凍狀態(tài)，待液氮消散，將樣品板置于組織破碎儀中振蕩破碎3min。需注意，2塊板中的樣品要對(duì)稱放置。

破碎結(jié)束后，加入2×CTAB 1000μL，將離心管放入浮板置于65℃水浴中2h;水浴過(guò)程中隔0.5h顛倒混勻1次;插入浮板后，浮板位于離心管中部靠上位置，既能使下部充分水浴，也能防止上部由于管口未蓋緊而浸入水。

水浴后，待離心管冷卻至室溫，加入24∶1氯仿-異戊醇800μL，輕柔顛倒混勻，靜置15min，4℃12000rpm·min-1離心15min，吸取上清至新管中。若上清不夠澄清，重復(fù)上一步驟。

加入-20℃預(yù)冷的無(wú)水乙醇1200μL，輕柔顛倒混勻，-20℃條件下放置20min，4℃ 12000rpm·min-1離心15min，去掉上清;若-20℃空間不足，也可放置于-40℃中;離心后管底可以觀察到白色絮狀沉淀。加入75%乙醇800μL，顛倒混勻，4℃ 12000rpm·min-1離心15min，去掉上清。將離心管插到浮板上開(kāi)口斜放，過(guò)夜干燥直到沉淀透明。

2.2 溶解核桃品種DNA及濃度檢測(cè)

加入TE buffer100μL及2‰RNase，4℃條件下靜置溶解4h;若短期內(nèi)可做完使用ddH2O溶解，長(zhǎng)期保存使用TE buffer。使用NanoDrop Spectrometer測(cè)定DNA濃度及純度。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA完整性。

2.3 制備核桃品種DNA工作液

DNA濃度稀釋至50ng·μL-1左右（標(biāo)準(zhǔn)濃度），260/230最低不要低于1.3，否則PCR及PAGE效果很差。

A 260nm：核酸最高吸收峰的吸收波長(zhǎng);A 280nm：蛋白質(zhì)最高吸收峰的吸收波長(zhǎng);A 270nm：酚的最大吸收峰;A 230nm：碳水化合物最高吸收峰的吸收波長(zhǎng)。

純DNA的260/280一般在1.8左右，大于1.9表明有RNA污染，小于1.6表明有蛋白質(zhì)、酚等污染。

2.4 核桃品種DNA保存

稀釋好的DNA樣品放入置物盒，標(biāo)號(hào)存檔，置于-80℃冰箱保存。

參考文獻(xiàn)

[1] 高煥章，趙振軍，蔡法律，向一兵，稅玉成，何玉枝，王進(jìn).湖北核桃種質(zhì)資源分析[J].長(zhǎng)江大學(xué)學(xué)報(bào)（自科版），2013，10（17）：8-10，14.

[2]袁海濤，董玉芝，王肇延.用最小距離逐步取樣法構(gòu)建野核桃核心種質(zhì)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012（07）：972-974.

[3]張力思，陳新，徐麗，魏海蓉，劉慶忠.核桃種質(zhì)資源工作現(xiàn)狀與展望[J].落葉果樹(shù)，2017，49（06）：18-22.

[4]王紅霞.我國(guó)核桃種質(zhì)資源及育種研究進(jìn)展[J].河北林果研究，2007，22（04）：387-392.

（責(zé)任編輯 ?李媛媛）