遠志抗凝血作用的物質基礎研究

李 娟 ，張 璇 ，陳彤垚 ，王倩玉 ，3，杜晨暉 ，秦雪梅 ，張福生 ，馬存根

（1.山西藥科職業學院藥學系，山西太原030031； 2.山西大學中醫藥現代研究中心，山西太原030006；3.山西大學化學化工學院，山西太原030006； 4.山西中醫藥大學，山西晉中030619）

遠志，始載于《神農本草經》，列為上品，是我國重要的大宗中藥材之一。遠志為遠志科植物遠志Polygala tenuifolia Willd. 或卵葉遠志Polygala sibirica L.的干燥根，在我國應用歷史悠久，其性味苦、辛、溫，歸心、腎、脾經，具有安神益智［1］、祛痰［2］、消腫等功效，常用于治療失眠多夢、健忘驚悸、神志恍惚、咳痰不爽、瘡瘍腫毒、乳房腫痛等［3］。目前，遠志屬其他藥用植物在全國不同地區應用廣泛，如長毛籽遠志（P.wattersii Hance.）、華南遠志（P.glomerata Lour.）、香港遠志（P.hongkongensis Hemsl.）等均具有活血、化瘀作用［4-8］。但有關遠志發揮抗凝血作用的物質基礎研究尚為空白，罕見報道。

本研究采用回流提取和溶劑萃取法得到遠志不同極性部位，使用經典的毛細管法測定小鼠凝血時間，篩選并比較了遠志抗凝血作用的有效部位。并采用高效液相色譜（HPLC）和氣相色譜-質譜聯用（GC-MS）分析對上述提取、分離的各部位進行了化學成分差異研究，探討了中藥材遠志發揮抗凝血作用的物質基礎，以期為開發遠志新的臨床用途提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗藥材

1.1.1 實驗動物 品系：SD 小鼠；性別：雄性；體質量：18~22 g；來源：北京維通利華實驗動物有限公司，動物合格證號：SCXK2011-0012，飼養：清潔級動物房常規飼養。置于自然晝夜節律光照條件下，自由進食、飲水，適應性飼養1 周后進行實驗。

1.1.2 實驗藥物 遠志筒藥材（Polygala tenuifolia）購買于河北安國藥材市場，樣品經山西大學中醫藥現代研究中心張福生副教授鑒定為正品。阿司匹林腸溶片（拜耳醫藥保健有限公司，批號20130078）。

1.1.3 試劑與儀器 Polygalaxanthone Ⅲ（MUST-14100905，純度≥98%，成都曼思特生物科技有限公司）；3，6′-disinapoyl sucrose（16011921，純度為98%成都普瑞法科技開發有限公司）；95%乙醇（分析純），石油醚（分析純），乙酸乙酯（分析純），正丁醇（分析純），以上試劑均為北京化工廠生產。

Waters e2695 高效液相色譜儀（配自動進樣器、四元梯度泵、柱溫箱、UV 檢測器；色譜柱為Venusil Agela MP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）。GCMS 聯用儀（Agilent 5977 B 氣質聯用儀，G4513A自動進樣器，四級桿質量分析器）；HP-5MS 毛細管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）。旋轉蒸發儀（RE-52A）上海亞榮生化儀器廠，正空干燥箱（DZF-1B）上海躍進醫療機器廠，調溫電熱套（ZDHW）北京市光明醫療儀器廠，超聲波清洗器（KQ5200E）昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 遠志藥材傳統水提取物的制備 稱取30 g遠志藥材（剪短至1~2 cm），置500 mL 的圓底燒瓶中，加入10 倍量蒸餾水（300 mL），加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，用抽濾瓶抽濾，濾液濃縮至一定體積，得水提物。

1.2.2 遠志藥材不同極性部位的制備 稱取250 g遠志藥材（剪短至1~2 cm），加10 倍量80%乙醇（2500 mL）浸泡過夜，加熱回流提取3 次，每次2 h，合并提取液，用抽濾瓶抽濾，濾液減壓回收至無醇味，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇對濾液各萃取3 次，回收溶劑，濃縮至浸膏，60 ℃真空干燥，分別得石油醚部位（部位A）、乙酸乙酯部位（部位B）、正丁醇部位（部位 C）、萃取水部位（部位 D）［9］，結果見圖1。部位A、B、C、D 分別溶于0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液，分別配制成濃度為0.013 15 g/mL、0.007 13 g/mL、0.056 21 g/mL、0.044 47 g/mL 的溶液。

圖1 遠志不同極性部位的制備流程圖

阿司匹林溶液（陽性對照）：使用時取阿司匹林片適量，用研缽磨成粉末，加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液適量，配制成濃度為1.271 mg/mL的溶液。

1.2.3 分組與給藥 取小鼠70 只，隨機分為7組，每組10 只。隨機分為空白組（0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液）、阿司匹林對照組、A 組、B 組、C 組、D組、E 組（水提物對照組），灌胃給藥體積0.1 mL/10 g，遠志成人臨床用藥劑量為3~10 g/60 kg，各部位所配劑量為人用最大劑量的 30 倍，即 5 g/kg［9］。

1.2.4 小鼠凝血時間的測定 對小鼠連續給藥8 d，于末次給藥 1 h 后，用長 7～10 cm、內徑 1 mm 的玻璃毛細管（上海新朋玻璃儀器有限公司，規格：0.9~1.1 mm，長度：10 cm，數量：500 根）插入小鼠眼內眥后靜脈叢中，深約4～5 mm，輕輕轉動再縮回，自血液流入毛細管內開始計時，血液注滿后取出毛細管平放于桌上，每隔約30 s 依次折斷毛細管的兩端（約0.5 cm），并緩慢向左右拉開，觀察折斷處是否有血凝絲，至血凝絲出現為止，所經歷時間即為凝血時間［10］，數據的平均值即為該小鼠的凝血時間。

1.3 統計學方法

實驗數據以均數±標準差（x±s）表示，運用SPSS 16.0 軟件進行統計分析，數據間比較采用獨立樣本t 檢驗。

2 結 果

2.1 遠志不同極性部位的HPLC 分析

液相條件：流動相為乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B）梯度洗脫，洗脫梯度如下：20：80→24：76（0～10 min），24：76→28：72（10～30 min），28：72→31：69（30～35 min），31：69（35～45 min），31：69→35：65（45～50 min），35：65→40：60（50～51 min），40：60→43：57（51～64 min），43：57→20：80（64～68 min）；檢測波長：316 nm；采集時間：68 min；柱溫：室溫；流速：1.0 mL/min；理論塔板數：以 3，6′-二芥子酰基蔗糖計不低于3000。

2.2 遠志不同極性部位的GC-MS 分析

分別稱取A、B、D 部位50 mg，各加入10 mL的玻璃試管中，分別加入2 mL 的甲醇-濃硫酸（10∶1）混合溶液，60 ℃水浴加熱 30 min，冷卻至室溫后，加入2 mL 正己烷與2 mL 蒸餾水振蕩萃取，待分層清晰后，分離上清液（正己烷層）作為分析試樣，進行GC-MS 分析。

2.3 小鼠凝血時間結果分析

阿司匹林、部位B、部位C、部位E 均能延長小鼠的凝血時間，與空白組相比差異有統計學意義（P＜0.05）。雖然部位 B、部位 C、部位 E 均能延長小鼠凝血時間（P＜0.05）；與空白組相比，部位E的P 值為0.049，趨近于0.05；而部位B 與部位C的P 值則分別為0.018 和0.031；從P 值的大小來判斷，上述3 個部位的抗凝血作用仍有較大的差異。按抗凝血活性的強弱排列：部位C＞部位B＞部位E。

但是部位C 組中有5 只小鼠先后出現死亡，經尸體解剖后發現，這5 只小鼠均出現了不同程度的胃腸道腫脹及腸脹氣。結果見表1，圖1。

表1 各提取部位對小鼠的凝血時間的影響

綜上，本研究將中藥材遠志提取、分離成若干不同極性部位，經體內動物實驗證明，部位B 和部位C 的抗凝血活性優于傳統水提物（部位E）。由于部位C 中所含的皂苷類成分較多，可能會引起一些不良反應，諸如胃腸脹氣或腸道壞死等。

2.4 遠志各分離部位的HPLC 分析

在遠志各分離部位的HPLC 圖譜中，口山酮Ⅲ/3，6′-二芥子酰基蔗糖為對照品指認［11］。結果見圖2。從圖2 中可以看出遠志各極性部位化學信息差異較大。部位B 與部位C 在①②區的化學成分種類及含量明顯豐富其他部位。部位C 在③區與其他部位也明顯不同，顯示其皂苷含量明顯高于其他部位。

部位A 在③皂苷區域幾乎沒有峰，在①口山酮區與②寡糖酯區峰個數微乎其微。部位B 在口山酮區與糖酯區的峰及其多，而皂苷區的峰相對比較少。部位C 在口山酮區與糖酯區的峰與部位B 的峰相似，但皂苷區的峰比遠志藥材甲醇提取物在此區域的峰個數都多，且含量較高。部位B、部位C 都有抗凝血作用，且前者的作用更優，因此可以推測遠志藥材抗凝血作用的有效部位應該主要集中在口山酮區和糖酯區。結果見圖3。

圖2 遠志不同極性部位的HPLC 疊加色譜圖

圖3 遠志不同極性部位的HPLC 色譜圖

2.5 遠志各分離部位的GC-MS 分析

從定性角度分析，A 部位與B 部位的總離子圖基本相似，結合NIST14.0 數據庫指認了含量均較高的棕櫚酸（1）、亞油酸（2）、油酸（3）。此外，B部位中保留時間為21.25 的色譜峰高于A 部位，且B 部位中保留時間為23.02 和29.18 的色譜峰在A 部位中沒有。而C 部位中不含有棕櫚酸、亞油酸和油酸。結果見圖4。

藥效學實驗表明，部位B 有抗凝血活性，而部位A 沒有抗凝血活性。區別與部位A、部位B 中含有2 個含量相對較高的色譜峰，保留時間分別為23.02 min 和29.18 min，而這兩個色譜峰可能與部位B 的抗凝血活性密切相關。結果見圖5。

圖4 遠志不同極性部位的GC-MS 總離子流圖

經查閱相關文獻得知，桃仁活血化瘀的物質基礎主要是油酸與亞油酸。故推測，遠志中抗凝血作用的物質基礎可能也與油酸和亞油酸相關，油酸、亞油酸在其中起到了一定的輔助作用［9］。

3 討 論

本研究將遠志藥材提取、分離成若干不同極性部位，經體內動物實驗證明遠志乙酸乙酯部位、正丁醇部位與傳統水提物均有一定的抗凝血作用，且乙酸乙酯部位和正丁醇部位的抗凝血活性優于傳統水提物。本研究也進一步對遠志藥材不同極性部位進行了抗凝血藥理活性研究，從HPLC分析結果來看，抗凝血作用的活性物質主要集中在口山酮區與糖酯區；從GC-MS 的結果來看，除了油酸和亞油酸以外，其他的脂肪酸類化合物應該也是遠志發揮抗凝血作用的物質基礎。由此可見，遠志藥材應該是通過多種活性成分協同作用，通過不同作用環節協同發揮了抗凝血作用。

《湖南省中藥材標準》《河南省中藥材標準》等地方標準均記載了遠志不同屬植物具有活血化瘀的藥用功效［12-20］，如黃楊遠志亞屬中的黃花遠志有補氣活血等功效；小扁豆亞屬中的長毛籽遠志有活血、舒經散血等功效；遠志亞屬中的西南遠志有活血止痛等功效。同科不同屬間的植物藥理作用應該相似［21］。因此本研究得出遠志乙酸乙酯部位、正丁醇部位與傳統水提物有一定的抗凝血作用這個結論與上述文獻及地方標準的結論是保持一致的。

本研究僅對中藥材遠志抗凝血作用的物質基礎進行了初步研究，因此遠志具體的抗凝血活性機制還有待后續的研究。后續可針對遠志的不同大類成分的抗凝血活性進行更全面的探索，以完善遠志的抗凝血活性物質基礎，為日后遠志的臨床應用奠定基礎，以開拓其更為廣闊的開發應用前景。