CTC檢測在預測肺癌復發轉移及患者預后中的意義

李 娜，姚 麗

(連云港市第二人民醫院東院檢驗科，江蘇 連云港 222000)

肺癌是臨床上常見的惡性腫瘤，且男性發病率略高于女性，成為威脅人群健康、生命的主要疾病之一[1]。肺癌病因復雜，普遍認為與長期大量吸煙、職業、電離輻射及遺傳因素有關[2]。患者發病早期臨床癥狀缺乏典型性，隨著病情的發展可表現為局部癥狀、全身癥狀、浸潤和轉移癥狀等[3]。目前，臨床上對于肺癌以手術、化療治療為主，雖然能延緩病情發展，延長患者壽命，但是部分患者治療后由于缺乏有效的預測指標，導致患者復發、轉移率較高，難以達到預期的治療效果[4]。循環腫瘤細胞(CTC)是指從原發病灶進入外周血液中的腫瘤細胞，但是臨床上，關于CTC水平與預測肺癌的復發、轉移及患者預后相關性研究較少[5]。因此，本文探討CTC在預測肺癌復發、轉移及患者預后中的應用價值，報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年4月至2015年4月治療的肺癌患者71例作為對象，設為觀察組，男41例，女30例，年齡35～88歲，平均(61.20±6.71)歲；病理類型：鱗癌25例，腺癌27例，腺鱗癌19例；腫瘤分期：Ⅰ～Ⅱ期34例，Ⅲ～Ⅳ期37例；分化程度：低分化23例，中分化36例，高分化12例。納入標準：(1)均符合肺癌臨床診斷標準[6]，均經病理組織檢查確診；(2)所有患者均為初次診斷，能在醫生指導下完成有關檢查與治療。選擇同期在本院體檢健康者55例，設為對照組，男30例，女25例，年齡34～87歲，平均(60.28±6.69)歲。排除標準：(1)合并其它肺部疾病或其它惡性腫瘤者；(2)合并精神異常、認知功能障礙、自身免疫系統疾病或凝血功能異常者；(3)近期使用其它方法治療或影響預后評估者。兩組臨床資料均無統計學意義(P>0.05)。

1.2 儀器與設備

Abbott i2000全自動免疫分析儀(雅培公司)、常溫臺式離心機(型號：TDL-40C)(上海安亭儀器公司)、Promax搖床(德國海盜爾夫Heidolph公司)、GL-802B型微型臺式真空泵(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)、熒光顯微鏡(上海順宇科技有限公司)、原位雜交儀(美國Westwood公司)、DAPI熒光保存液(賽特生物醫藥科技有限公司)、Triton X-100(上海波光生物科技有限公司)。

1.3 循環腫瘤細胞富集方法

1.3.1 標本采集 觀察組患者均為初次診斷后入院治療，分別于治療前和治療完成后，采集患者早晨空腹靜脈血10 mL，對照組健康體檢當天空腹狀態下取靜脈血10 mL，并放置在含EDTA的抗凝管中備用。

1.3.2 磁珠富集 取淋巴細胞分離液與血液標本，混合后進行加熱，控制加熱溫度為18～25 ℃，充分混合抗凝血7.5 mL及等量PBS液，經貼壁后緩慢導入淋巴細胞分離層，常溫下進行20 min離心，離心力1463 g，獲得環狀乳白色單個核細胞層，采用PBS清洗2次，15 min離心，離心力1463 g。將細胞沉淀懸浮在磁珠緩沖液80 μL中，向緩沖液中加入CD45抗體20 μL，充分混合后進行15 min孵育，溫度為4 ℃，加入磁珠緩沖液2 mL，10 min離心，離心力1463 g。去除上層清液，向獲得的細胞沉淀中加入緩沖液500 μL完成細胞重懸，經磁珠MS分流柱后加入磁珠緩沖液500 μL，采用MS分流柱進行2次清洗。取分流柱分流出的液體，10 min離心，離心力1463 g后去除上清，將細胞沉淀放置在防脫載玻片中風干，在濃度為4%多聚甲醛中固定，見圖1[7]。

圖1 循環腫瘤細胞富集過程部分示意圖

1.4 熒光染色

利用PBS對制備的載玻片進行3次清洗，每次清洗5 min，清洗完畢后采用BAS進行0.5 h封閉，然后，再用PBS清洗3次，每次5 min。向獲得的溶液中加入小鼠抗人廣譜細胞角蛋白，4 ℃下過夜，PBS清洗3次，每次5 min，然后向溶液中加入小鼠IgG(采用FITC標記)，常溫下孵育120 min，PBS清洗3次，每次5 min。在細胞區域加入DAPI感染的細胞核7 μL，加入蓋玻片封固，在免疫熒光顯微鏡下觀察、拍照[8-9]。

1.5 復發轉移及預后評估

統計觀察組患者的性別、年齡、腫瘤病理類型、腫瘤分期、轉移、復發、預后等資料，分析CTC陽性率與患者臨床病理特征和預后、復發、轉移的關系。

患者預后情況采用recist標準評價[10]：①完全緩解(CR)：病灶全部消失；②部分緩解(PR)：病灶范圍較前縮小30%以上；③疾病穩定(SD)：病灶范圍縮小不超過30%，增大小于20%；④疾病進展(PD)：病灶范圍增大超過20%或出現新發的轉移灶或遠處轉移灶。將CR、PR歸為預后良好，將SD、PD歸為預后一般。CT和MRI等影像學檢查發現原發病灶和局部有新的病灶出現定義為肺癌復發，當發現大腦或肝臟、脾臟、骨骼等其它部位轉移病灶時定義為肺癌轉移。

1.6 統計分析

2 結 果

2.1 兩組CTC陽性率比較

觀察組有39例發現CTC陽性，CTC陽性率為54.93%，對照組有2例CTC陽性，CTC陽性為3.64%，差異有統計學意義(P<0.05)，說明肺癌患者外周血CTC陽性率高于健康人群。

2.2 CTC陽性率與患者臨床病理特征和預后、復發、轉移的關系

肺癌患者CTC陽性率與腫瘤分期、分化程度、預后、復發及轉移有關，Ⅲ～Ⅳ期腫瘤、低分化程度、預后一般、存在復發轉移的患者，其CTC陽性率明顯大于Ⅰ～Ⅱ期腫瘤、中高分化程度、預后良好、不存在復發轉移的患者，差異均有統計學意義(P<0.05)。肺癌患者CTC陽性率與性別、年齡、病理類型無關，不同性別、年齡和病理類型的患者，其CTC陽性率比較差異均無統計學意義(P>0.05)，見表1。

2.3 肺癌患者復發、轉移及預后與CTC陽性率相關性

Pearson相關性分析結果表明：肺癌患者復發、轉移與CTC陽性率呈正相關性(P<0.05)；肺癌患者預后與CTC陽性率呈負相關性(P<0.05)，見表2。

3 討 論

目前，臨床上對于肺癌以手術治療、放化療為主，手術能有效的切除病灶組織，延長患者壽命[11]；放化療則能殺死腫瘤組織，控制病情持續發生。但是，無論何種治療方法均存在明顯的局限性，再加上患者治療后由于缺乏有效的預后評估指標，導致患者死亡率、復發率較高，影響患者預后[12]。

表1 39例CTC陽性患者臨床病理特征和預后、復發、轉移的關系

表2 肺癌患者復發、轉移及預后與CTC陽性率相關性

目前臨床上對于肺癌的診斷、預后和復發轉移的判斷主要依靠CT、MRI等影像學檢測以及病理活檢手段，然而這些手段對于微小病灶的檢出能力有限，很難做出準確的判斷，而且在肺癌的治療過程中很難實現動態監測。CTC不同于影像檢查和病理診斷，只需要通過采集外周血即可獲取，所以能夠實現動態監測，在肺癌的治療過程中，可通過CTC的動態變化來評估治療效果，從而及時調整肺癌的治療方案。此外CTC在肺癌復發轉移的風險評估中也有重要作用，影像學檢測是無法判斷患者復發轉移的風險，當能夠檢測到病灶存在時實際上已經發生了復發轉移。而CTC則不同，腫瘤的復發轉移主要就是通過血液系統傳播的，可以通過檢測血液中的CTC，提前評估復發轉移的風險。

本研究中，觀察組肺癌患者中CTC陽性率顯著高于對照組，說明CTC在肺癌患者中陽性率較高，能參與疾病的發生、發展。CTC最早在19世紀首次提出，后經不斷研究探索發現其存在于惡性腫瘤患者外周血循環中，且在良性疾病或健康人群中水平較低。對于肺癌患者而言，腫瘤細胞可自發，亦可由于治療過程中擠壓、器械觸碰等進入血液中[13]。部分CTC進入外周循環中可以通過機體免疫識別及自然殺傷細胞作用而凋亡，僅有極少數CTC能逃避免疫監視存活，并且通過遷移、相互聚集、黏附等方式形成微小癌栓，在特定的作用下演變為轉移灶，從而影響患者預后。本研究中，觀察組肺癌組織中CTC陽性率與腫瘤分期、分化程度、預后、復發及轉移具有統計學意義(P<0.05)，說明CTC在肺癌患者中水平受到的影響因素較多，加強CTC細胞測定能反應患者的疾病嚴重程度。臨床研究表明[14]：對于肺癌患者而言，CTC檢測對預測患者預后具有更高的敏感性，它能對患者疾病嚴重程度和治療效果進行準確評估[15]。本研究中，Pearson相關性分析結果表明：肺癌患者復發、轉移與CTC陽性率呈正相關性(P<0.05)；肺癌患者預后與CTC陽性率呈負相關性(P<0.05)，說明CTC細胞陽性率與患者的預后、轉移及復發存在緊密的聯系。

綜上所述，CTC在肺癌患者中陽性率較高，能預測患者復發、轉移，有助于評估患者預后，能為臨床治療方案的調整提供依據和參考。