糖尿病腎組織PPARγ和PTEN的表達及對EMT和纖維化的影響

徐慶東，郭煥開，蘇 明，陳潔欣，馬惠娟，鄧繼鴻，姜松青，石曉峰

(江門市中心醫院腎內科，廣東 江門 529000)

糖尿病腎病(diabetic nephropathy，DN)的發病機制尚未完全清楚，臨床療效不甚理想，因此，進一步探索DN發病機制，尋求新的有效的防治措施對治療DN具有重要意義。腎小管間質纖維化(renal tubular interstitial fibrosis，RTIF)是DN的主要病理變化之一[1]，臨床研究和動物實驗證實，DN的發病進程中，腎小管上皮細胞(renal tubular epithelial cells，RTECs)通過特定程序轉化為間質表型細胞，即上皮細胞間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)使細胞外基質大量沉積，引起腎小管間質纖維化、變性、萎縮、消失[2]。第10號染色體缺失的磷酸酶和張力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homology deleted on chromosome ten，PTEN)基因編碼的蛋白具有抗纖維化效應[3]，過氧化物酶體增殖物激活受體γ(eroxisome proliferator-activated receptor γ，PPARγ)能在轉錄水平調控PTEN，延緩DN進展[4]。本研究通過探索糖尿病小鼠及高糖培養的腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN的表達變化，擬進一步完善PPARγ、PTEN與糖尿病的EMT和腎纖維化的關系。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及細胞

C57BL小鼠，SPF級，體質量為(30±5)g，由廣東省醫學實驗動物中心提供。大鼠腎小管上皮細胞株(NRK52E)購自上海斯信生物科技有限公司。

1.2 主要試劑及儀器

鏈脲佐菌素(Streptozotocin，STZ)購自Sigma(美國)公司；磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)購自北京索萊寶科技有限公司；兩步法免疫組化檢測試劑盒購自cell signaling technology(CST)公司；4%多聚甲醛(polyformaldehyde，PFA)磷酸緩沖液、中性樹膠封片劑購自上海生工生物工程股份有限公司；二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)購自Sigma(美國)公司；雙花扁豆凝集素(dolichos bifows agglutinin，DBA)試劑盒、胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)、胰蛋白酶、DMEM培養基、低分子量蛋白Marker、RNA提取試劑盒、Trizol試劑盒，BCA蛋白定量試劑盒為賽默飛世爾科技產品。一抗鼠抗β-actin、一抗兔抗PPARγ、一抗兔抗PTEN、兔抗E-cadherin、鼠抗α-SMA、兔抗CollagenⅢ、二抗生物素標記羊抗兔、二抗羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG)等抗體均購自上海生工生物工程股份有限公司；實時熒光定量PCR儀購自賽默飛世爾科技公司；PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司設計完成。

1.3 細胞實驗

1.3.1 細胞培養 將本室凍存的NRK-52E大鼠腎細胞株，置于37 ℃、5% CO2培養箱中孵育，48 h換液一次，取對數期細胞進行實驗。

1.3.2 細胞分組 根據培養基中葡萄糖的含量，將細胞分為正常糖量的對照組和高糖量的實驗組，在2% FBS的DMEM培養基中，對照組的葡萄糖濃度為5.5%；實驗組的葡萄糖濃度為25%，分別在6孔板中培養細胞48 h，然后，分別用蛋白質免疫印跡(Western Blot)、實時熒光定量聚合酶鏈反應(real time fluorescent quantitative polymerase reaction，qRT-PCR)測定目標蛋白和基因的表達。

1.4 糖尿病(DM)小鼠模型的構建

STZ溶于無菌的pH4.5，0.01 mol/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液中，腹腔注射給予C57BL小鼠STZ溶液55 mg/kg，連續注射5天，第5天注射給藥后72 h，空腹測血糖，血糖≥16.7 mmol/L、尿糖陽性即為糖尿病小鼠(實驗組)。

另取正常小鼠10只作為對照組，腹腔注射無菌pH4.5、0.01 mol/L的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，連續注射5天，第5天注射給藥后72 h，空腹測血糖。實驗期間兩組小鼠均正常飲食飲水，連續喂養8周，處死小鼠，取腎臟，一側腎臟固定于4% PFA溶液中制作石蠟切片，進行病理檢查、免疫組化檢測。另一側腎臟加入生理鹽水研磨，提取總蛋白和RNA，進行Western Blot、qRT-PCR檢測。

1.5 腎組織病理學檢測

腎組織用中性甲醛固定制成石蠟切片，分別用蘇木精-伊紅(Hatmatoxylin-Eosin，HE)、高碘酸-無色品紅(periodic acid solferino，PAS)、Masson、高碘酸烏洛托品銀(periodic acid-silver-methenamine，PASM)進行染色，染色步驟嚴格按照試劑盒要求進行，光鏡下觀察腎組織形態結構變化及纖維化情況。

1.6 Western blot檢測

取兩組小鼠腎組織和腎小管上皮細胞，提取總蛋白，Western blot檢測PPARγ、PTEN蛋白、EMT蛋白、α-SMA，CollagenⅢ、E-cadherin蛋白表達情況。

1.7 qRT-PCR檢測

取兩組小鼠腎組織和腎小管上皮細胞，提取RNA，qRT-PCR檢測PPARγ、PTEN mRNA表達情況。PPARγ引物：上游為5′-CGCAGTTCTGAGCUGGCGACT-3′，下游為5′-TGGACAGACCCGAACTGATGG-3′；PTEN引物：上游為5′-CTTAAGTTCAGTCCGGAACTTG-3′，下游為：5′-GGCATCAGCATGGAACTAGAC-3′，內參引物：5′-GAATGCTGACTGGGAAATTGAG-3′，下游為：5′-ACATTCATCATGGCAGTAACT-3′。反應條件：95 ℃反應10 min后，在95 ℃ 15 s、72 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s，共循環40次，重復3次，所得試驗數據采用RQ=2-△△Ct計算PPARγ、PTEN mRNA表達情況。

1.8 熒光素酶檢測PPARγ轉錄活性

氧化酶體增殖物反應原件熒光素酶報告質粒(Addgene plasmid 1015)由本實驗室保存，取兩組腎組織及腎小管上皮細胞，培養24 h后將相同數量各組系膜細胞裂解，加反應底物，檢測熒光強度，將熒光強度進行對數轉換后統計分析。

1.9 統計學分析

2 結 果

2.1 兩組小鼠腎組織病理變化

如見圖1所示，腎組織分別用HE、PAS、PASM染色，對照組小鼠腎小球及基底膜形態完整、結構清晰，腎小管未出現擴張、壞死、硬化等現象。實驗組小鼠腎小球系膜增生、出現同心圓狀的結節狀硬化。腎小管管腔擴張、上皮細胞腫脹、變性、呈空泡狀，基底膜不規則增厚，出現大量炎性細胞浸潤，腎小管間質區PAS染色陽性物質增多。Masson染色顯示，對照組未出現膠原沉積，實驗組小鼠腎小管管腔明顯擴張、腎小球及腎間質見大量被染成藍紫色條索狀的膠原纖維沉積。

圖1 兩組小鼠腎組織HE、PAS、Masson、PASM染色(400×)

2.2 小鼠腎組織及腎小管上皮細胞中PPARγ、PTEN蛋白的表達

Western Blot顯示，與對照組比較，實驗組腎組織及及高糖培養下腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN蛋白表達水平顯著降低(P<0.01，見圖2)。

2.3 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細胞中PPARγ、PTEN mRNA的表達

qRT-PCR結果顯示，與對照組比較，實驗組腎組織及高糖培養下腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN mRNA表達水平顯著降低(P<0.01，見圖3)。

圖2 兩組小鼠腎組織及高糖培養下腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN蛋白表達水平A：電泳圖，B：PPARγ、PTEN與β-actin比值的相對密度圖；與對照組比較，*P<0.01

圖3 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細胞中PPARγ、PTEN mRNA表達水平與對照組比較，*P<0.01

2.4 小鼠腎組織EMT及纖維化

Western Blot顯示，與對照組比較，實驗組腎組織及高糖培養下腎小管上皮細胞中的E-cadherin蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達水平顯著增高(P<0.01，見圖4)。

2.5 小鼠腎組織及及腎小管上皮細胞PPARγ轉錄活性

與對照組比較，實驗組腎組織及及腎小管上皮細胞PPARγ轉錄活性均明顯增高(P<0.01)，見圖5。

圖4 兩組小鼠腎組織及腎小管上皮細胞E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達水平A：電泳圖，B：三種檢測蛋白與β-actin比值的相對密度圖；與對照組比較，*P<0.01

圖5 兩組小鼠腎組織及及腎小管上皮細胞PPARγ轉錄活性與對照組比較，*P<0.01

2.6 PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達的相關性

對體外培養腎小管上皮細胞中PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達量相關性進行分析，PTEN與PPARγ及E-cadherin呈顯著正相關，與α-SMA、Collagen-Ⅲ呈顯著負相關，見表1。

表1 PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達的相關性分析

3 討 論

PTEN基因定位于人類第十號染色體上[5]，該基因能編碼具有脂質磷酸酶活性和蛋白磷酸酶活性的雙重特異性磷酸酶，是一種雙重活性抑癌基因[6]。過往對PTEN的研究主要集中于腫瘤，能參與調控多條信號通路及細胞周期蛋白通路，發揮抑制細胞增殖、遷移、黏附、誘導細胞凋亡，抑制血管生成等作用[7]。文獻報道，PTEN是足細胞胰島素敏感性調控的關鍵分子之一，是引發DN的重要因子[8]。DN發病時，PTEN表達降低，與腎組織纖維化密切相關[9]。過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator-activated receptors，PPARs)是一種核轉錄因子[10]，是核受體超家族成員，有α、β、γ三種亞型[11]。其中，PPARγ在腎小球、近曲小管、腎臟纖維細胞等組織中有廣泛表達[12]，研究發現，在糖尿病小鼠模型中，PPARγ能直接降低尿蛋白而不降低血糖[13]。而且，PPARγ通過與PTEN上游的過氧化物酶體增生物反應元件結合，參與PTEN的調控[14]。本實驗結果顯示，經高糖處理后，DN小鼠腎組織及高糖培養下腎小管上皮細胞中的PPARγ、PTEN的蛋白及mRNA表達水平均較正常小鼠顯著降低，提示高糖不僅使PPARγ表達水平降低，還降低PTEN的表達水平，且蛋白和mRNA降低水平和趨勢相同。有文獻報道，PPARγ轉錄活性在系膜細胞表型轉化中具有重要作用，與DN發生發展密切相關，而高糖可抑制PPARγ轉錄活性。本文結果顯示，DN小鼠腎組織及及高糖培養的腎小管上皮細胞，PPARγ轉錄活性均明顯低于對照組。

Iwano等人[15]研究發現，36%的間質成纖維細胞來源于RTECs，說明間質成纖維細胞的重要來源是EMT。EMT發生時，EMT的標志性蛋白表達發生改變，如波形蛋白(Vimentin)被激活，α-SMA表達增加，E-cadherin表達減少[16]。本研究結果顯示，正常小鼠腎組織和腎小管上皮細胞中的E-cadherin蛋白表達水平較高，α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達水平較低，DN小鼠腎組織及高糖培養下腎小管上皮細胞中的E-cadherin蛋白表達水平顯著低于對照組，而α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達水平顯著高于對照組，提示高糖能促進EMT的進展，促進腎組織和腎小管上皮細胞纖維化。對小鼠腎組織進行HE、PAS、PASM、Masson染色發現，與對照組比較，實驗組小鼠腎小球系膜增生、出現同心圓狀結節狀硬化；腎小管管腔擴張、上皮細胞腫脹、變性、呈空泡狀，基底膜不規則增厚，出現大量炎性細胞浸潤，腎小管間質區PAS染色陽性物質增多，小鼠腎小管管腔明顯擴張，腎小球及腎間質見大量被染成藍紫色條索狀的膠原纖維沉積，提示在發生EMT時，確實發生了腎小管間質纖維化。對腎小管上皮細胞中PTEN蛋白與PPARγ、E-cadherin、α-SMA、Collagen-Ⅲ蛋白表達量的相關性分析結果表明，PTEN與PPARγ(r=0.71)及E-cadherin(r=0.62)的表達呈正相關，與α-SMA(r=-0.66)、Collagen-Ⅲ(r=-0.59)的表達呈顯著負相關，這與文獻報道一致[17]。

綜上所述，機體在高糖的環境中，腎組織和腎小管上皮細胞中的PPARγ與PTEN的表達水平顯著降低，E-cadherin，上調α-SMA、Collagen-Ⅲ的表達下調，腎組織出現EMT及纖維化改變。其機制有待于進一步研究。