灸療對失眠大鼠腦組織γ-氨基丁酸轉運體表達及組穴配伍研究

乎寶力格，澈力木格，高玉峰

(內蒙古民族大學附屬醫院，內蒙古 通遼 028007)

失眠不僅僅是老年人的常見癥狀，而且越來越年輕化，嚴重影響人們的健康。這與社會競爭壓力的日益加劇及人際關系的復雜化有關，是當今醫學領域的研究重點。

蒙醫灸療法(拖吶胡扎薩拉)為蒙醫傳統療法之一，是將艾草條或艾草柱燒灼后在人體特定穴位或病變部位，直接或間接地給予溫熱感而達到預防或治療目的。《素問·異法方易論》中有“北方者，天地所閉藏之域也。其地高陵居，風寒冰冽，其民樂野處而乳食，藏寒生滿病，其治宜灸，故灸焫者，亦從北方來”的記載。

灸療法療效奇特、無毒副作用、簡便易操作，在治療失眠、焦慮、抑郁方面有獨特的優勢。蒙醫學中赫依三穴指的是頂會穴(敖瑞音博樂其日)、赫依穴(赫依音博樂其日)、黑白際穴(哈日查干乃博樂其日)。赫依穴(赫依音博樂其日)位于頸椎第七棘突與胸椎第一棘突間隙窩中，主治：心悸、夜不安寐、白晝嗜眠、耳聾、耳鳴、頭暈頭痛、頸項強直等癥；頂會穴(敖瑞音博樂其日)位于兩耳角連線中點，即頭頂正中心，主治：赫依性音啞癥、巴達干性視力減退、神志不清、癲狂、頭暈頭痛等癥；黑白際穴(哈日查干乃博樂其日)位于兩乳正中的心窩處，主治：心悸、心前區不適、夜不安寐等癥。

在前期研究[1-7]中發現施灸赫依三穴可改善模型大鼠睡眠，調節下丘腦-垂體-腎上腺(HPA)軸相關調節因子5-羥色胺(5-HT)、去甲腎上腺素(NE)、多巴胺(DA)等神經遞質及白介素1(IL-1)、白介素6(IL-6)、腫瘤壞死因子(TNF-α)等細胞因子。

據研究[8]，γ-氨基丁酸轉運體(GAT)也是HPA軸重要的調節因子。GAT不僅參與對HPA軸的調節，同時也直接參與了對睡眠的調節。

GAT[9]是一種糖蛋白，位于神經元及膠質膜上，GAT在腦組織內的作用是攝取突觸間隙及細胞外液的γ-氨基丁酸，從而終止γ-氨基丁酸的抑制作用，即終止或控制睡眠障礙、焦慮抑郁及精神錯亂等神經系統性疾病的發生或發展。相反，GAT表達異常會導致γ-氨基丁酸神經信號傳遞，從而導致各種神經系統疾病的發生。GAT分為4種，即GAT-1、GAT-2、GAT-3、GAT-4，其中GAT-1是最主要的神經元轉運蛋白，GAT-1的動態變化在一定程度上代表了GABA能神經元的變化。

本實驗擬用蒙醫灸療取有效腧穴——赫依三穴，作用于失眠模型大鼠，觀察模型大鼠行為學變化，運用PCR方法，觀察大鼠腦干組織GAT-1的表達及二三穴組穴配伍后GAT-1的表達變化，探究灸療在失眠治療中的可能作用機制及組穴配伍后的作用機制。

1 實驗材料

1.1 動物

100只SD實驗大鼠，體重(200±5)g，購自沈陽市實驗動物中心，合格證-SXSK(遼)2015-0001。

1.2 試劑及儀器

對氯苯丙氨酸(PCPA)由北京環亞太克生物醫學技術有限公司提供，TRNzol總RNA提取試劑由天根生化科技(北京)有限公司提供，艾灸貼購自蘇州東方艾絨廠，AUW120D型島津電子天平(日本島津)，QL-902型渦旋振蕩儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)，Tanon 1600型凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)，ABI7500型熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

2 方法

2.1 模型建立

本實驗采用PCPA造模法[9]，將PCPA用生理鹽水配置成混懸液(45 mg/100 g)。除正常組，其他組腹腔注射PCPA混懸液(1 mg/100 g)，每天8∶00注射1次，連續注射2天。第一次注射24 h后大鼠已開始走動舉肢頻繁、對外界刺激敏感、晝伏夜出節律消失等睡眠障礙癥狀。

2.2 選穴依據與原則

選穴：依據《中國醫學百科全書(蒙醫學)》[10]及《蒙醫實驗療術學》[11]取有效腧穴——赫依三穴，即頂會穴、赫依穴、黑白際穴。

2.3 分組及干預方法

將100只SD大鼠隨機分為10組，即正常對照組、模型組、安定組(陽性對照組)、單穴組(頂會穴組、赫依穴組、黑白際穴組)，二三穴組(頂會穴與赫依穴組、頂會穴與黑白際穴組、赫依穴與黑白際穴組、三穴組)，每組10只。 正常組：腹腔注射0.9%氯化鈉溶液(1 mL/100 g)，每日1次，連續2日注射；第三天開始每天抓取、固定1次，不做其他處理，連續7天。模型組：第三天開始每天抓取、固定1次，不做其他處理，連續7天。安定組：第三天開始，每日1次灌胃安定(地西泮)注射液，0.92 mg/kg，連續7天。頂會穴組：第三天開始，施灸大鼠“頂會穴”，每日1次，每次施灸5 min(約三個艾灸貼)，連續7天。赫依穴組：第三天開始，施灸大鼠“赫依穴”，每日1次，每次5 min，連續7天。黑白際穴組：第三天開始，施灸大鼠“黑白際穴”，每日1次，每次5 min，連續7天。頂會穴與赫依穴組：第三天開始，同時施灸頂會穴與赫依穴，每日施灸1次，每次5 min，連續7天。頂會穴與黑白際穴組：第三天開始，同時施灸頂會穴與黑白際穴，每日施灸1次，每次5 min，連續7天。赫依穴與黑白際穴組：第三天開始，同時施灸赫依穴與黑白際穴，每日施灸1次，每次5 min，連續7天。三穴組：第三天開始，同時施灸頂會穴、赫依穴與黑白際穴，每日施灸1次，每次5 min，連續7天。

2.4 觀察指標及檢測方法

取大鼠腦干組織，放入液氮罐中冷凍，再存儲于-80 ℃冰箱中備用。選取GAT-1引物序列；腦組織置入1 mLTrizol中加入0.2 mL氯仿，室溫孵育10 min，4 ℃ 12 000 r/min離心15 min，取上層液，加入等體積異丙醇，混勻，室溫孵育10 min，4 ℃12 000 r/min離心10 min，沉淀物通過DEPC水洗滌后，提取出腦組織總RNA。將RNA轉錄成cDNA，PCR擴增，產物用凝膠成像系統觀察結果、照相，用半定量分析凝膠成像系統軟件測定各電泳帶光密度值。

2.5 統計方法

2.6 統計分析

2.6.1 蒙醫灸療法對SD大鼠腦組織中GAT-1的影響 ①與正常組相比，模型組腦干GAT-1含量降低，差異有顯著性(P<0.05)；②與模型組相比，安定組及各治療組GAT-1含量更降低，差異有顯著性(P<0.05)。見表1、圖1。

表1 蒙醫灸療法對SD大鼠腦組織中GAT-1的影響

注：圖中數字1代表正常組，數字2代表模型組，數字3代表安定組，數字4代表赫依組，數字5代表頂會，數字6代表黑白際組GAT-1含量。

2.6.2 二三穴組穴配伍后蒙醫灸療對模型大鼠腦干組織中GAT-1含量的影響 與模型組相比，各治療組GAT-1含量更降低，差異有顯著性(P<0.05)。見表2、圖2。

表2 組穴配伍后蒙醫灸療法對模型大鼠腦干組織中GAT-1的影響

注：圖中數字1、2代表正常組，數字3、4代表模型組，數字5、6代表安定組，數字7、8代表赫依頂會組，數字9、10代表黑白際頂會穴組，數字11、12代表赫依黑白際穴組，數字13、14代表三穴組GAT-1含量。

3 討論

蒙醫學中三根(赫依、希拉、巴達干)是生命活動的三種能量和基本物質，三根互相制約，互相依存，保持機體的平衡。三根失去平衡是引起疾病最根本的原因，其中赫依既是一切疾病的前導，也是一切疾病的末尾[10-12]。人體在飲食(過量進食味苦、性輕食物)、起居(起居陰涼)、氣候(長期冷風吹襲)、其他(驚嚇)等四個發病條件的作用下，赫依偏勝，三根失去平衡，氣血紊亂累及心臟與白脈，從而引起失眠，因此，大多屬赫依病范疇。而蒙醫灸療法則是鎮赫依之邪，抑制赫依病擴散、醒腦開竅之良方[13]。蒙醫學經典著作《甘露四部》[14]中記載：“赫依增多則出現身體黑瘦、喜暖、頭暈、失眠，體力衰弱……”“赫依偏盛引起的疾病以敖瑞音博樂其日、赫依音博樂其日、哈日查干乃博樂其日灸之……”。 臨床中，在頂會穴、赫依穴、黑白際穴等穴位上施灸，可治療心煩易怒、心悸、失眠等各種赫依性病癥。而且施灸單穴或施灸二三穴配伍治療均具有抗失眠的療效。

γ-氨基丁酸(GABA)是一種抑制性神經遞質，存在于哺乳動物樞神經系統中[15-16]。GABA神經元興奮時，GABA被神經末梢釋放到突觸間隙，并通過與位于突觸后膜的GABA受體結合發揮作用。終止遞質的作用主要依賴位于突觸前膜和膠質細胞膜的GAT對突觸間隙內的GABA的攝取功能。GAT對已釋放的GABA的攝取作用能有效控制突觸間隙GABA濃度及潴留時間，從而調控GABA神經信號傳導，防止神經細胞過于興奮，調理睡眠。

據研究[8-9]，中樞神經系統性疾病，如睡眠障礙、焦慮、抑郁及各種輕中重度疼痛都與 GABA的抑制性突觸傳遞作用有密切關系，調節轉運體蛋白功能，可作為治療中樞神經系統疾病的新方法。研究證明GAT-1是最主要的神經元轉運蛋白，GAT-1的動態變化在一定程度上代表了GABA能神經元的變化，在實驗中可作為觀察指標。

該實驗中，大鼠腹腔注射PCPA后 24 h開始出現走動次數明顯，舉肢、不能安臥等外部特征。安定組與各灸療組開始干預后大鼠精神狀態好轉，整體觀察與模型組不同，GAT-1的表達也較模型組下降，表示安定組與灸療組改善了實驗動物的失眠癥狀。推測赫依三穴在單穴治療和組穴配伍后的治療中，對PCR法檢測的GAT-1的表達有著共同的降低調節作用。從RNA水平證實了蒙醫灸療鎮靜催眠作用機制，證實了施灸赫依三穴在單穴治療和組穴配伍治療中均有鎮靜催眠作用。