夏天無(wú)醇提物對(duì)實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠的干預(yù)作用及機(jī)制研究

潘榮斌，占惠唯，鄒進(jìn)發(fā)，張 迪，陳 喬

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌 330004)

腦出血(Intracerebral hemorrhage，ICH)是指非外傷性所致的腦實(shí)質(zhì)自發(fā)性出血，常見(jiàn)病因有高血壓、顱內(nèi)血管畸形、腦動(dòng)脈硬化等，其主要癥狀表現(xiàn)為突然昏迷、半身不遂、口舌歪斜、言語(yǔ)不利或失語(yǔ)、偏麻等[1]。在國(guó)內(nèi)一項(xiàng)流行病學(xué)調(diào)查統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，ICH發(fā)病率高達(dá)85.4/10萬(wàn)，其病死率更高達(dá)41.3%，且患者慢性傷殘率為39.1%[2]。可見(jiàn)，ICH已成為目前世界范圍內(nèi)一個(gè)危害人類健康的社會(huì)問(wèn)題，研究其發(fā)病機(jī)制及干預(yù)治療手段具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

研究證實(shí)ICH最重要病理改變是血腫本身及其繼發(fā)性周圍腦缺血、腦水腫和細(xì)胞毒性等損傷[3]，其中最常見(jiàn)的是炎性介質(zhì)和凝血酶變化，參與損傷機(jī)制的過(guò)程相互作用。由此，保護(hù)ICH性腦組織損傷關(guān)鍵在于抗炎及消腫[4]。但目前ICH發(fā)生、發(fā)展病理機(jī)制尚不清楚，且目前治療方法缺乏循證醫(yī)學(xué)證據(jù)及明確病理機(jī)制支撐，更缺乏特異性靶向性治療。在諸多中藥材中，夏天無(wú)有活血化瘀、消炎止痛的功效，臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)復(fù)方夏天無(wú)治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎療效好[5]，其對(duì)炎癥反應(yīng)各個(gè)環(huán)節(jié)，如炎性滲出、炎性介質(zhì)釋放以及炎癥后期肉芽組織增生均具有抗炎作用[6]。本課題組運(yùn)用夏天無(wú)醇提物干預(yù)ICH模型大鼠，通過(guò)神經(jīng)行為學(xué)、病理變化及NF-κB、GFAP、CD34蛋白免疫組化檢測(cè)，旨在探討夏天無(wú)對(duì)ICH大鼠的干預(yù)作用及其可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)2月齡健康雄性SD大鼠70只，體重(200±20)g，合格證號(hào)為SCXK(湘)2016-0002，購(gòu)于湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。環(huán)境溫度(25±2)℃，相對(duì)濕度55%～65%，自由飲水。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)動(dòng)物倫理委員會(huì)審核。

1.2 藥品

藥品均購(gòu)于江西省中醫(yī)院藥房。夏天無(wú)飲片生藥(批號(hào)：20150715)；腦血康膠囊(山東昊福藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批號(hào)：Z10960009)。

1.3 主要儀器設(shè)備

OLYMPUS顯微鏡系統(tǒng)(日本OLYMPUS公司)；石蠟切片機(jī)(RM2135型，德國(guó)Leica公司)；石蠟包埋機(jī)(德國(guó)Leica公司)；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器有限公司)；培養(yǎng)性/干燥箱兩用箱(上海一恒科技有限公司)。

1.4 主要試劑

DAB顯示劑(博士德生物科技有限公司，批號(hào)：CW0125M)；SABC免疫組化染色試劑盒(博士德生物科技有限公司，批號(hào)：12G20B)；兔抗鼠NF-κB多克隆抗體(Abcam公司，批號(hào)：ab16502)；兔抗鼠CD34多克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs-0646R)；兔抗鼠GFAP單克隆抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：bs-0199R)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 藥液制備

稱取夏天無(wú)飲片500 g加入500 mL的95%乙醇浸泡過(guò)夜后，冷凝回流水浴80 ℃提取30 min，倒出藥液，再加入300 mL的95%乙醇提取15 min后倒出，合并藥液，轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至50 mL，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿內(nèi)，烘干形成膠狀提取物；后用雙蒸水及適量吐溫-80溶解，配成相對(duì)生藥濃度為2、1、0.5 g/mL的藥液，于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩Ｓ蒙睇}水將腦血康膠囊配制成濃度為30 mg/mL藥液備用。

2.2 動(dòng)物分組

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組、用藥高、中、低濃度組及術(shù)前用藥組，每組10只。

2.3 造模

麻醉、備皮、消毒。正中切開(kāi)顱頂皮膚約1.5 cm，輕輕刮除顱骨表面腱膜及顱骨外膜。參照大鼠腦圖譜，在顱頂前囟前0.96 mm，正中矢狀線右側(cè)3 mm處切開(kāi)一個(gè)1 mm×1 mm 左右小孔，暴露硬腦膜(注意保護(hù)硬腦膜完整)。用37 ℃溫水加溫鼠尾，待其充血后酒精消毒，斷尾取血，迅速用微量注射器吸取新鮮血液50 μL。腦立體定位儀固定微量注射器，調(diào)整針尖移至開(kāi)孔處，以輕微接觸硬腦膜為宜，設(shè)置Z軸原點(diǎn)，調(diào)整Z軸向下移動(dòng)6 mm[7]。采用二次注血二次退針?lè)ㄟM(jìn)行造模，即先注入10 μL，停針2 min，繼續(xù)緩慢勻速注入40 μL，留針約4 min，退針2 mm，再停針約4 min，緩慢將注射器完全退出[8]。停針期間，對(duì)鼠尾傷口進(jìn)行消毒止血處理。術(shù)后用骨蠟封閉顱骨創(chuàng)口，縫合頭皮并用碘伏消毒，防止傷口感染。假手術(shù)組大鼠前期操作一致，注血步驟時(shí)，僅將針插入，不注射血液。

2.4 給藥

所有動(dòng)物按1次/d、1 mL/100 g量給藥。術(shù)前用藥組于造模前灌胃30 d，夏天無(wú)醇提物量相對(duì)生藥濃度為1 g/mL，高、中、低濃度組生藥濃度分別為2、1、0.5 g/mL，陽(yáng)性對(duì)照組腦血康濃度30 mg/mL，模型組及假手術(shù)組以等體積生理鹽水灌胃即可。以上大鼠均在麻醉清醒后(約術(shù)后3 h)開(kāi)始給藥，直至7 d后處死取材。

2.5 神經(jīng)行為學(xué)檢測(cè)

按Longa法進(jìn)行大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分[9]，標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。自造模后第2天開(kāi)始，對(duì)各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)性行為評(píng)價(jià)。將大鼠輕置于空曠平坦的地面，不對(duì)其行動(dòng)進(jìn)行干擾，只觀察并記錄其運(yùn)動(dòng)情況，根據(jù)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分。

2.6 HE染色

給藥結(jié)束后，將大鼠灌注固定并取材[10]，取大鼠注血中心點(diǎn)前后2 mm區(qū)組織塊，包埋后連續(xù)冠狀位切片，片厚4 μm，修片后，每隔3片取1張，每樣本相鄰切片分為四套，每套6張，選取一套做常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察。

表1 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.7 免疫組化檢測(cè)

剩余切片用于免疫組化染色，兔抗鼠NF-κB多克隆抗體稀釋濃度為1∶200，兔抗鼠GFAP單克隆抗體稀釋濃度為1∶400，兔抗鼠CD34多克隆抗體稀釋濃度為1∶400。顯微鏡下(10×40倍)觀察注血周圍區(qū)NF-κB、GFAP及CD34陽(yáng)性表達(dá)情況，每張切片隨機(jī)選取3個(gè)相鄰視野，采集圖像后，軟件Image J2x，計(jì)算相應(yīng)的平均光密度值，以3個(gè)視野平均光密度值之和平均數(shù)作為一個(gè)標(biāo)本計(jì)數(shù)值，再以該值對(duì)各組大鼠注血尾殼核周邊區(qū)平均光密度值總數(shù)作統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用(平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，先將數(shù)據(jù)做正態(tài)分布檢驗(yàn)以及方差齊性檢驗(yàn)，各組間免疫組化結(jié)果采用單因素方差分析，方差分析具有顯著性時(shí)，組間兩兩比較進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 longa評(píng)分結(jié)果

參照評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)各實(shí)驗(yàn)組大鼠進(jìn)行各時(shí)間段神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分，因剔除死亡或造模失敗原因減員，每組剩余6只進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，觀察預(yù)防及治療效果。

表2 大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分

通過(guò)大鼠神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分結(jié)果可見(jiàn)，所有實(shí)驗(yàn)組與假手術(shù)組相比較均具有顯著性差異(P<0.01)，在藥物治療7 d后，術(shù)前用藥組及用藥低濃度組與假手術(shù)組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；用藥組與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、用藥高濃度組、用藥中濃度組、用藥低濃度組在用藥前5 d幾乎無(wú)差別，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；用藥第6天，陽(yáng)性對(duì)照組、用藥高濃度組、用藥中濃度組、用藥低濃度組與模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；用藥第7天，陽(yáng)性對(duì)照組、用藥高濃度組、用藥低濃度組與模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)；術(shù)前用藥組與模型組相比，第1、2、4天時(shí)，與模型組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，第7天時(shí)，與模型組有顯著性差異(P<0.01)。

3.2 夏天無(wú)醇提物對(duì)組織實(shí)驗(yàn)性ICH注血周圍區(qū)腦組織病理形態(tài)學(xué)影響結(jié)果(HE染色)

假手術(shù)組注血區(qū)周圍組織緊密，細(xì)胞形態(tài)完整，染色均勻，腦白質(zhì)完整，邊界清晰，核仁清晰明顯，胞質(zhì)均勻；模型組注血區(qū)周圍組織較為松散，壞死細(xì)胞較多，細(xì)胞核濃縮，胞質(zhì)淡染，腦白質(zhì)受損嚴(yán)重，邊界模糊，出現(xiàn)水腫現(xiàn)象；各給藥組注血區(qū)周圍組織緊密程度不一，但均較模型組更為緊密，細(xì)胞壞死程度不一，但均較模型組少；伊紅染色較為均勻，均沒(méi)有出現(xiàn)濃染，腦白質(zhì)均受到一定程度的損傷，但沒(méi)有模型組嚴(yán)重，部分邊界清晰。

不同濃度給藥組差異明顯，用藥高濃度組注血區(qū)周圍組織最為緊密，用藥中濃度組次之，用藥低濃度組最為松散；用藥高濃度組形態(tài)完好的細(xì)胞最多、壞死細(xì)胞最少，用藥低濃度組形態(tài)完好細(xì)胞最少、壞死細(xì)胞最多；三組伊紅染色都較為均勻，未出現(xiàn)伊紅濃染情況，用藥高濃度組腦白質(zhì)受損最輕，部分邊界清晰，用藥中濃度組腦白質(zhì)受損程度居中，邊界較為模糊，用藥低濃度組腦白質(zhì)受損較為嚴(yán)重，邊界模糊，詳見(jiàn)圖1。

3.3 夏天無(wú)醇提物對(duì)大鼠尾殼核周邊區(qū)NF-κB蛋白表達(dá)的影響(免疫組化)

在藥物治療7 d后，所有大鼠處死取材尾殼核手術(shù)區(qū)周圍NF-κB蛋白表達(dá)隨著炎癥程度的升高而增加，與假手術(shù)組相比，實(shí)驗(yàn)組均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)，其中與模型組、術(shù)前用藥組、用藥中濃度組、用藥低濃度組有顯著性差異(P<0.01)；與模型組相比，陽(yáng)性對(duì)照組、術(shù)前用藥組均有顯著性差異(P<0.01)，用藥高濃度組、用藥低濃度組有顯性差異(P<0.05)，而用藥中濃度組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)差異(P>0.05)。詳見(jiàn)表3。

3.4 夏天無(wú)醇提物對(duì)大鼠尾殼核周邊區(qū)GFAP蛋白表達(dá)的影響(免疫組化)

假手術(shù)組腦組織GFAP陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞較少，染色淺，細(xì)胞規(guī)則，輪廓清晰，分布較為規(guī)律。模型組腦組織GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)最多，表達(dá)量最高，同時(shí)在形態(tài)上，細(xì)胞胞體增大，突起明顯且不規(guī)則，部分呈簇狀分布，與用藥組及假手術(shù)組相比，均有顯著性差異(P<0.01)，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)顯示，GFAP表達(dá)量與用藥濃度成反比，詳見(jiàn)表3。

圖1 夏天無(wú)醇提物對(duì)組織實(shí)驗(yàn)性ICH注血周圍區(qū)腦組織病理形態(tài)學(xué)影響(HE染色10×40)

3.5 夏天無(wú)醇提物對(duì)大鼠尾殼核周邊區(qū)CD34蛋白表達(dá)的影響(免疫組化)

各組間比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中假手術(shù)組CD34陽(yáng)性微血管數(shù)較少，模型中表達(dá)量最高，用藥干預(yù)組與陽(yáng)性用藥對(duì)照組均低于模型組，在用藥組織CD34的表達(dá)與濃度呈一定的反比關(guān)系，見(jiàn)表3。

表3 夏天無(wú)對(duì)大鼠尾殼核周邊區(qū)NF-κB、GFAP、CD34蛋白表達(dá)的影響

4 討論

ICH作為致死率與致殘率極高的一類疾病，在全球發(fā)病率為10～30人/10萬(wàn)[11]，占腦卒中總數(shù)的10%～15%。Flaherty ML等[12]對(duì)ICH患者進(jìn)行了2個(gè)隊(duì)列研究，統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，1周的病死率為30%，1年內(nèi)病死率為50%以上，該研究組隨后對(duì)183名患者進(jìn)行10年隨訪，其病死率高達(dá)82%。ICH導(dǎo)致如此高死亡率最重要的病理改變是血腫本身及其引發(fā)的繼發(fā)性周圍腦缺血和腦水腫及細(xì)胞毒性等損傷[1]。Hua等[13]認(rèn)為出血后的血腫占位并不是引起ICH損傷的關(guān)鍵因素，而出血后腦水腫所引起的繼發(fā)性傷害及釋放的活性物質(zhì)是造成ICH損傷的主要因素，其中最常見(jiàn)的是炎性介質(zhì)和凝血酶的變化，而參與損傷機(jī)制的過(guò)程又相互作用，由此，保護(hù)ICH性腦組織損傷的關(guān)鍵在于抗炎及消腫。核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)作為一個(gè)重要介質(zhì)激活和釋放多種炎癥介質(zhì)參與ICH后的炎癥反應(yīng)，造成腦損傷[14]。一方面可以促進(jìn)炎性因子IL-1β、ICAM-1等的表達(dá)[15]，另一方面，上調(diào)MMP-9的表達(dá)，破壞血腦屏障，加重血管源性腦水腫[16]并促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[17]。膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)作為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，檢測(cè)GFAP蛋白表達(dá)變化，可以有效反映星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生情況及神經(jīng)系統(tǒng)損傷程度[18]。在出現(xiàn)腦出血情況時(shí)，出血區(qū)周圍組織水腫、缺血缺氧，刺激星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)GFAP的合成，并增加神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌[19]，以提升神經(jīng)元短期內(nèi)的耐受性；隨著后期炎癥的加劇，星形膠質(zhì)細(xì)胞受損GFAP向周圍彌散，形成片區(qū)分布。CD34分子是一類高度糖基化的i型跨膜糖蛋白，在眾多炎癥反應(yīng)中異常出現(xiàn)表達(dá)，介導(dǎo)白細(xì)胞的聚集，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，同時(shí)協(xié)同趨化因子作用增強(qiáng)炎癥反應(yīng)[20]。

大鼠腦血管解剖結(jié)構(gòu)與人類相似，尾殼核是腦內(nèi)最大核團(tuán)，易于定位且位于基底節(jié)，是人類高血壓ICH的好發(fā)部位[21]。采用自體血注入尾殼核法制作的ICH模型進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，ICH后的繼發(fā)性腦損害和水腫形成的機(jī)制是多方面的，同時(shí)，大鼠未肝素化模型產(chǎn)生的水腫比肝素化模型嚴(yán)重[22]。因該模型產(chǎn)生效果與臨床病癥相似，自體血注入尾殼核法用于制作ICH模型，相比其他方法而言，實(shí)驗(yàn)結(jié)果將更加可靠，具有穩(wěn)定性以及可復(fù)制性[23-25]，已被大多數(shù)研究所采用。

傳統(tǒng)中藥夏天無(wú)臨床常用于治療腦梗死，周圍神經(jīng)損害性癱瘓、腰椎間盤突出癥、癡呆、坐骨神經(jīng)痛、關(guān)節(jié)腰腿等疼痛等[26-30]。將夏天無(wú)應(yīng)用于大鼠實(shí)驗(yàn)性腦血栓模型中發(fā)現(xiàn)，夏天無(wú)能夠抑制血栓的形成，減輕腦血栓引起的腦水腫及腦損傷[31]，并有相關(guān)研究表明夏天無(wú)對(duì)喹啉酸損毀海馬所致大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯的改善作用[32]。

本實(shí)驗(yàn)設(shè)置術(shù)前用藥組，術(shù)后高、中、低用藥干預(yù)組，陽(yáng)性對(duì)照組等不同組別，采用神經(jīng)行為學(xué)評(píng)價(jià)、HE染色形態(tài)學(xué)觀察及免疫組化檢測(cè)進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示，夏天無(wú)術(shù)前給藥30 d后，能夠較大程度緩解自體血注射對(duì)大鼠行為學(xué)變化及降低注血周圍區(qū)NF-κB、GFAP及CD34蛋白的表達(dá)，即表明夏天無(wú)醇提物具有一定程度的ICH預(yù)防作用。從不同時(shí)間段各組大鼠神經(jīng)行為學(xué)變化可以發(fā)現(xiàn)，隨著給藥時(shí)間的延長(zhǎng)，恢復(fù)速度逐漸增強(qiáng)，分析原因可能與用藥干預(yù)及大鼠自體恢復(fù)共同作用的結(jié)果。最后，不同濃度夏天無(wú)給藥干預(yù)后，NF-κB、GFAP、CD34蛋白表達(dá)存在明顯差異，初步結(jié)果顯示，NF-κB、GFAP、CD34蛋白表達(dá)與給藥濃度呈負(fù)相關(guān)性，即給藥濃度越高，NF-κB、GFAP、CD34蛋白越少，反之亦然。此現(xiàn)象表明，夏天無(wú)醇提物對(duì)實(shí)驗(yàn)性ICH具有治療作用，能夠改善實(shí)驗(yàn)性腦出血大鼠行為學(xué)作用，用藥后ICU區(qū)病變程度降低，NF-κB、GFAP、CD34蛋白表達(dá)減少。由此得出結(jié)論：夏天無(wú)醇提物對(duì)腦出血大鼠具有預(yù)防和治療作用，推測(cè)其神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制可能與抑制腦出血處血栓形成及消除炎癥反應(yīng)相關(guān)。