丹參、澤瀉對非酒精性脂肪肝大鼠氧化應激和血管內皮的影響

路 帥，郭建利，彪雅寧，張一昕，3，石 鋮，劉 晨，韓 雪，3*

(1.石家莊醫學高等專科學校 藥學系，河北 石家莊 050599；2.河北中醫學院 藥學院，河北 石家莊 050200；3.河北省高校中藥組方制劑應用技術研究中心，河北 石家莊 050091)

非酒精性脂肪肝(Non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)以廣泛性肝細胞呈現較大空泡性脂肪變性和脂肪大量蓄積為主要表現，且無過量飲酒史的代謝性疾病[1-2]。由于生活水平提高，不良飲食習慣，日益增加的工作壓力，網絡信息環境的沖擊等，NAFLD發病率逐年升高[3]，患者出現內皮功能失調，進而引發動脈粥樣硬化[4-5]。

中醫基本理論將非酒精性脂肪肝歸屬于“痰濁”“血瘀”“癥瘕”“積聚”等范疇。本研究認為，痰濕、瘀血為NAFLD主要病理基礎，以活血消痰為根本治法。丹參功效為活血祛瘀、涼血消癰、養血安神，丹參所含脂溶性成分如丹參酮能改善血液循環、抗菌消炎，水溶性成分具有抗氧化、抗凝血、抗血栓、調節血脂等作用[6]。澤瀉能夠利水濕、消痰濁，以萜類為主要化學成分，具有降血糖、抗血栓和抑制斑塊等作用[7]。本課題主要探究丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉對NAFLD大鼠的保護作用是否與改善氧化應激水平和血管內皮功能有關，現報告如下。

1 材料

1.1 動物

雄性SD大鼠60只，體質量：(200±20)g，購于河北醫科大學動物實驗中心(合格證號：1603048)。

1.2 藥物

丹參、澤瀉購于河北省石家莊市樂仁堂藥店，水煎至所需濃度；東寶甘泰片購于通化東寶藥業股份有限公司(批號：151204)。

1.3 試劑

游離脂肪酸(FFA)、甘油三酯(TG)、膽固醇(TC)、天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)試劑盒購于北京中生生物工程技術公司(批號分別為201611、201615、201605、201609、201602)；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒購于南京建成生物工程研究所(批號：201611、201605)；內皮素(ET-1)、6-酮-前列腺素F1α(6-Keto-PGF1α)、血栓烷B2(TXB2)放射免疫試劑盒購于北京普爾偉業生物科技有限公司(批號分別為201601、201612、201615)。

2 方法

2.1 分組

60只大鼠隨機分為6組：正常組(C)、模型對照組(M)、丹參水煎劑組(S，5 g·kg-1)、澤瀉水煎劑組(R，3.33 g·kg-1)、丹澤水煎劑組(SR，8.33 g·kg-1)、陽性藥(東寶甘泰)對照組(D，1.25 g·kg-1)，每組10只。

2.2 造模

正常組喂飼普通飼料，其余各組均給予高脂飼料[8](配方：1.5%膽固醇+0.5%膽鹽+10%豬油+88%基礎飼料)，連續9周。

2.3 給藥

從造模第1天開始，正常組和模型對照組灌服蒸餾水，丹參水煎劑組、澤瀉水煎劑組、丹澤水煎劑組、東寶甘泰組灌服相應藥物，每日1次，用藥體積為1 mL/100 g，連續8周。

2.4 取材

8周末，4%烏拉坦麻醉，股動脈取血，分離血清待檢，同時迅速剖取適宜大小的肝組織于4%多聚甲醛液中固定。

2.5 指標檢測

酶法測定血清TC、TG、FFA含量；賴氏法測定 AST、ALT的活性；采用黃嘌呤氧化酶法測定SOD活性；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸比色分析法；放射免疫分析法測定大鼠血漿ET-1、6-Keto-PGF1α和TXB2含量。

2.6 統計分析

3 結果

3.1 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠血清TC、TG、FFA含量的影響

NAFLD大鼠血清TC、TG、FFA的含量較正常組明顯升高(P<0.01)，證明造模成功，丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組大鼠血清TC、TG、FFA的含量較模型組均明顯降低(P<0.01)。其中，丹澤組TC含量明顯低于丹參組和澤瀉組(P<0.01)。見表1。

表1 各組大鼠血清TC、TG、FFA的含量

3.2 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠血清ALT和AST活性的影響

NAFLD大鼠血清ALT、AST的活性較正常組明顯升高(P<0.01)，丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組大鼠血清ALT、AST的活性較模型組均明顯降低(P<0.01)。其中，丹參組、澤瀉組及丹澤組血清ALT的活性均低于東寶甘泰對照組(P<0.01或P<0.05)，丹澤組ALT活性明顯低于丹參組和澤瀉組(P<0.01)；丹澤組AST活性低于對照組(P<0.05)，丹澤組AST活性明顯低于丹參組(P<0.01)。見表 2。

表2 各組大鼠ALT和AST的活性

3.3 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠血清SOD和MDA活性或含量的影響

NAFLD大鼠SOD的活性較正常組明顯降低，MDA的含量較正常組明顯升高(P<0.01)，丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組SOD的活性均明顯升高(P<0.01)，MDA的含量明顯降低(P<0.01)。丹參和澤瀉組血清SOD的活性均低于東寶甘泰對照組(P<0.01)；丹澤組在升高SOD的活性、降低MDA含量方面的作用明顯優于丹參組和澤瀉組(P<0.01)。見表3。

表3 各組大鼠SOD和MDA的活性或含量

3.4 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠肝組織形態學的影響

結果顯示(如圖1所示)：正常組大鼠肝細胞為多邊形，排列呈放射狀，較為整齊，無腫脹及脂肪變性。模型組大鼠肝細胞顯現中度水腫，發生明顯的脂肪變性，部分肝細胞中脂滴融合成大的脂肪空泡。各給藥組肝細胞脂肪變性程度均有所減輕。

注：A.正常組；B.模型組；C.東寶甘泰組；D.丹參組；E.澤瀉組；F.丹澤組。

3.5 丹參、澤瀉對NAFLD大鼠血漿ET、6-Keto-PGF1α和TXB2含量的變化

NAFLD大鼠血漿ET含量較正常組明顯升高(P<0.01)。丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組大鼠血漿ET含量較模型組明顯降低(P<0.01)。其中，丹參組、澤瀉組和丹澤組的血漿ET含量均低于東寶甘泰對照組(P<0.01或P<0.05)，而丹澤組血漿ET含量明顯低于丹參組和澤瀉組(P<0.01)。見表4。

NAFLD大鼠血漿6-Keto-PGF1α含量較正常組明顯降低(P<0.01)，TXB2含量明顯升高(P<0.01)。丹參、澤瀉、丹澤及東寶甘泰組大鼠血漿6-Keto-PGF1α含量明顯升高(P<0.01或P<0.05)，血漿TXB2含量明顯降低(P<0.01)。其中，丹澤組血漿TXB2含量明顯低于東寶甘泰對照組(P<0.01)，而丹澤組血漿TXB2含量低于丹參組和澤瀉組(P<0.05)。見表4。

3 討論

中醫基本理論將非酒精性脂肪肝歸屬于“痰濁”“血瘀”“癥瘕”“積聚”等范疇。本研究認為，現代生活水平較高，人們往往嗜食肥甘，又久坐少動，使脾胃運化失調，痰濁內生，氣血阻滯，致肝失條達而發為本病，故痰濕瘀血為非酒精性脂肪肝的主要病理基礎，故以活血化痰為基本治法[9]。本研究篩選出臨床常用的治療非酒精性脂肪肝的中藥丹參和澤瀉，丹參活血祛瘀、涼血消癰、養血安神，現代研究證實其具有改善血液循環、抗菌消炎、抗氧化、抗凝血、抗血栓、調節血脂、降低脂質過氧化反應的作用[4-5]。澤瀉能夠利水濕、消痰濁，具有抗血栓、抗血小板聚集和抑制斑塊的作用[7]。

表4 各組大鼠ET-1、6-Keto-PGF1α and TXB2的變化

本實驗結果發現丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉能明顯降低NAFLD模型大鼠血清TC、TG、FFA含量，降低ALT和AST的活性，呈現出良好的降脂和保肝作用。FFA可能是氧化應激的根源，高脂飲食，血清FFA大量增加，TG大量蓄積在肝細胞內，使線粒體氧化速度代償性加快，大量FFA氧化生成 ROS，超過機體抗氧化機制清除能力將引起氧化應激。SOD是體內酶類自由基清除劑，過氧化的產物MDA的大量增加證明機體內脂質過氧化反應增多，導致肝臟炎癥、纖維化和肝細胞死亡，從而加重脂肪肝[10]。本實驗結果提示丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉能增強NAFLD大鼠血清SOD活性，降低MDA含量，證明其良好的抗氧化作用。正常情況下ALT和AST存在于肝細胞內，肝臟損傷時，其從肝細胞中釋放入血，因而通過檢測血清中ALT和AST的活性能夠反映丹參、澤瀉對NAFLD大鼠肝細胞損傷的保護作用[10]。本實驗中丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉能降低NAFLD大鼠血清ALT和AST活性，提示其對肝臟具有保護作用。

內皮細胞功能異常會引起血管舒縮失衡、內皮滲透性增加、血小板聚集等。有研究證實：NAFLD患者普遍存在超重、血脂高、肝功異常、空腹血糖偏高及血管內皮細胞功能障礙等[11]。內皮素(ET)、一氧化氮( NO)、血栓素(TXA)、前列環素(PGF)為具有強烈促進血管收縮和舒張作用的血管活性物質，其中，ET與TXA為血管收縮因子，NO與PGF為血管舒張因子，相互協調，維持血管正常的收縮和舒張。非酒精性脂肪肝會引起血管內皮功能異常，如血管舒張因子分泌相對減少，血管收縮因子分泌相對增多[12]。ET在肝臟合成，有3種異構體，其中，在肝臟合成的ET-1是作用最強的一種，其含量增加會引起肝血竇收縮，肝循環障礙及肝細胞缺氧，加重脂質過氧化，直接損傷肝細胞，促進肝纖維化[13-14]。TXB2、6-Keto-PGF1α是人體內微循環調節系統的一部分，二者相互拮抗并協調，防止血栓形成。TXB2增多，6-Keto-PGF1α減少會影響肝臟微循環，導致肝細胞功能障礙，變性壞死及纖維化[15]。

本研究結果顯示，丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉水煎劑能明顯改善血中6-Keto-PGF1α、ET、TXB2含量的異常變化，提示丹參、澤瀉及丹參配伍澤瀉水煎劑可能通過調節ET和6-Keto-PGF1α、TXB2的分泌和釋放，達到保護血管內皮功能、降低脂質過氧化的作用，這可能是其防治NAFLD的分子機制之一。