潔白膠囊生產過程中不同滅菌工藝對產品質量的影響

楊琪琪，董建斌，王蘭霞，朱旭江，李士博

(1.甘肅中醫藥大學，甘肅 蘭州730000；2.蘭州和盛堂制藥股份有限公司，甘肅 蘭州 730000；3.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730000)

潔白膠囊為藏族驗方，是2015版《中國藥典》一部中收載的“潔白丸”的改進劑型，處方中包含14味藥材，除五靈脂膏外，訶子等十三味藥材均以原粉入藥[1]。在生產過程中，以藥材原粉入藥的中藥制劑要求控制微生物水平[2]。實驗研究發現，市售潔白膠囊和進入生產車間滅菌前的潔白膠囊原粉的HPLC圖譜有較大差異，主要表現在圖譜中某些色譜峰的升高或降低。查閱相關文獻[3-8]發現，潔白膠囊處方中藥材多含揮發性成分，實驗組推測可能是在滅菌過程中由于滅菌溫度控制不當，造成藥品中某些成分的損失。為進一步較好地控制生產過程，細化工藝參數，課題組提出“中藥制劑生產過程中微生物質量管理和質量保證”的研究內容，嘗試優化潔白膠囊等含揮發性成分的中藥制劑生產過程中的低溫滅菌工藝，既能保證微生物限度合格，也能使產品質量有所保障。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜儀：HITACHI Chromaster(日本日立)；色譜柱：資生堂CAPCELL PAK MG C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；超聲波清洗器(昆山市超聲波儀器，KQ-500DE)；電熱鼓風干燥箱(上海博訊實業有限公司醫療設備廠，GZX-9146MBE)；十萬分之一電子天平(MS205DU)、萬分之一電子天平(ME204)均購自瑞士梅特勒公司。

1.2 試藥

對照品：沒食子酸(110831-200803，90.1%)購于中國食品藥品檢定研究院，鞣花酸(72340010，99.9%)購于上海安譜實驗科技股份有限公司；磷酸(分析純)；實驗水(超純水)；乙腈(進口色譜純)。潔白膠囊原粉由甘肅某藥企提供。

2 方法和結果

2.1 滅菌工藝

參考2015年版《中國藥典》，若藥品中的相關物質對熱不敏感，可首選過度殺滅法進行滅菌，若藥品中相關物質對熱敏感，其滅菌方法的選擇取決于在一定的時間內，一定的生產批次的被滅菌物品微生物污染的水平及其耐熱性[9]，且結合相關文獻，一般藥物滅菌時溫度不高于80 ℃為宜[10]，實驗組選定6個滅菌工藝(見表1)，經過滅菌后，比較6種滅菌工藝的微生物水平。

表1 潔白膠囊滅菌工藝

將混合均勻的潔白膠囊原粉稱取約50 g，每個編號2份平行樣品，共12份樣品(1份做微生物水平實驗，1份做HPLC圖譜實驗)，裝入清洗干凈滅過菌(防止外源性污染造成實驗數據的不可靠)的玻璃容器中，按表1編號對試驗樣品進行編號，準備工作完成后，將準備好的樣品置于電熱鼓風干燥箱中按上述滅菌條件對樣品進行滅菌，比較微生物水平，結果見表2。

表2 不同滅菌工藝微生物水平實驗結果

由表2可以看出，6種滅菌工藝均符合2015年版《中國藥典》對含藥材原粉的中藥制劑的微生物限度的要求，因此，對熱敏感成分的中藥制劑可采用低溫滅菌，但具體采用哪一種滅菌工藝，還需要進行HPLC圖譜的比較，滅菌前后無明顯變化則為最佳滅菌工藝。

2.2 HPLC圖譜

2.2.1 色譜條件 色譜柱：資生堂CAPCELL PAK MG C18色譜柱；流動相：乙腈-0.05%磷酸水溶液梯度洗脫(見表3)；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL；波長：254 nm；柱溫：30 ℃。

表3 梯度洗脫程序

2.2.2 對照品溶液配制 采用稱量盤精密稱取鞣花酸16.53 mg，用80%甲醇溶解并定容至50 mL容量瓶中，作為儲備液Ⅰ；另同法稱取沒食子酸對照品21.35 mg，用80%甲醇溶解并定容至25 mL容量瓶中，作為儲備液Ⅱ；從儲備液Ⅰ中精密量取8 mL，儲備液Ⅱ中精密量取1 mL，定容至10 mL容量瓶中，即得濃度分別為0.264 215 52 mg/mL的鞣花酸和0.076 945 4 mg/mL的沒食子酸混合對照品溶液。

2.2.3 樣品溶液制備 精密稱定6個編號潔白膠囊原粉0.2 g(見表4)，置于錐形瓶中，精密加甲醇20 mL，稱重后超聲處理30 min，冷卻后用甲醇補足失重，混合均勻后靜置，取續濾液，即得。

表4 潔白膠囊不同滅菌工藝的取樣量

2.2.4 測定方法 分別精密吸取上述兩種溶液各10 μL，注入液相色譜儀，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以鞣花酸色譜峰的保留時間和峰面積為1，計算其他各峰的相對保留時間和相對峰面積，結果見圖1和表5、表6。

圖1 HPLC色譜

由圖1、表5、表6可以看出，樣品在滅菌前后色譜峰的個數并未增加或減少，只是原有色譜峰的相對峰面積發生變化，表6所示，滅菌工藝2和5兩者相對峰面積更接近于滅菌前的相對峰面積，考慮到節約成本等實際生產情況，選擇滅菌工藝2(滅菌溫度60 ℃，滅菌時間12 h)為最佳滅菌工藝。

2.2.5 方法學考察 (1)專屬性考察。取滅菌工藝2的供試品溶液10 μL、混合對照品溶液，按上述色譜條件進樣分析，記錄色譜，結果見圖1。通過專屬性實驗結果表明該分析方法能正確檢測所指認的特征峰，該方法可行。

(2)精密度考察。取滅菌工藝2的潔白膠囊原粉約0.2 g，精密稱定，按照“2.2.3”項下處理，連續進樣6次測定，以鞣花酸色譜峰為參照峰，計算峰1～峰11的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD值，實驗結果見表7和表8。實驗結果顯示，在精密度考察中，連續6次進樣的色譜峰相對保留時間RSD在0.001%～0.002%范圍內，相對峰面積RSD在0.001%～0.022%范圍內，表明儀器精密度良好。

(3)重復性考察。取滅菌工藝2的潔白膠囊原粉，約0.2 g，平行6份，精密稱定，按照“2.2.3”項下方法處理，以8號峰鞣花酸色譜峰為參照峰，計算峰1～峰11的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD值，實驗結果見表9和表10。

表5 滅菌前后相對保留時間數據對比

表6 滅菌前后相對峰面積數據對比

表7 潔白膠囊樣品精密度考察結果(相對保留時間)

表8 潔白膠囊樣品精密度考察結果(相對峰面積)

表9 潔白膠囊樣品相對保留時間重復性考察結果

表10 潔白膠囊樣品相對峰面積重復性考察結果

實驗結果顯示，6份供試品溶液中11個特征峰相對保留時間RSD在0.001%之內，相對峰面積RSD在0.002%～0.042%范圍內，表明該方法重復性良好。

(4)穩定性考察。取滅菌工藝2的潔白膠囊原粉，取約0.2g，精密稱定，按“2.2.3”項下處理，分別在0、4、8、12、24 h進樣分析，以8號峰鞣花酸色譜峰為參照峰，計算峰1～峰11的相對保留時間和相對峰面積，并計算RSD值，實驗結果見表11和表12。

表11 潔白膠囊樣品相對保留時間穩定性考察結果 (min)

表12 潔白膠囊樣品相對峰面積穩定性考察結果

實驗結果顯示，供試品溶液在24 h內11個特征峰相對保留時間RSD在0.001%～0.002%之內，相對峰面積RSD在0.003%～0.114%范圍內，表明供試品溶液在24 h內相對穩定。

3 討論

微生物滅菌過程中，樣品材料需粉碎成粗粉，過二號篩，以保證樣品的均一性，同時實驗過程中為了確保樣品在滅菌結束后不受外源性污染物的影響，本研究采用阻止微生物通過的橡膠塞，確保實驗結果的可靠。相關文獻[11]提到，滅菌要求須使F0≥8，對于含揮發性成分的中藥制劑，可使F0=8，因受實驗條件限制，未能對滅菌工藝進行更細化的研究，期望在后續實驗過程中完善這一環節。

經計算，滅菌溫度60 ℃，滅菌時間12 h時，滅菌前后沒食子酸和鞣花酸含量基本不發生變化，其他滅菌條件下微生物限度雖然也達標，但二者含量與滅菌前相差較大，故不作為最佳滅菌條件考慮。同時HPLC圖譜實驗過程中，還對樣品的提取方式(如提取溶劑、提取時間等)和耐用性(如不同柱溫、不同流速等)進行了相應的考察，考察結果顯示提取溶劑為甲醇，超聲處理30 min時樣品峰形較好，且在一定的范圍內，不同柱溫、不同流速對樣品峰形峰面積并無太大影響，說明該方法耐用性好，可作為HPLC圖譜過程控制方法。

通過以上研究發現，6種不同的滅菌工藝對潔白膠囊原粉的產品質量有不同程度的影響，考慮到實際生產，選取滅菌工藝2(滅菌溫度60 ℃，滅菌時間12 h)為最佳滅菌工藝，既能保證微生物限度合格，又能控制潔白膠囊的產品質量。

以原粉入藥的中藥制劑在生產過程中都存在微生物控制這一環節，本試驗研究了潔白膠囊的滅菌工藝對產品質量的影響，課題組也對大蜜丸做過類似的比較研究，發現滅菌工藝與制劑類型有一定的相關性，限于時間因素，并未對劑型和滅菌工藝的相關性做進一步研究，后續實驗會以此為出發點，選取同一種劑型的多種中成藥進行詳細研究，從特殊中找到一般規律，為企業生產過程中微生物的控制提供技術指導。