鐵皮石斛破壁粉工藝參數對質量參數的影響研究

石 雪，唐明華，陳毅堅，黃雕順

(1.云南品斛堂生物科技有限公司，云南 保山 678300；2.云南師范大學，云南 昆明 650000；3.云南民族大學，云南 昆明 650000；4.黔西南州南盤江國有林場，貴州 興義 562400)

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimura et Migo．)是蘭科石斛屬多年附生草本植物，以新鮮或者干燥莖入藥，也叫黑節草[1]。野生鐵皮石斛為國家重點二級保護植物。《本草正義》記載：“必以皮色深綠，質地堅實，生嚼之脂膏黏舌，味厚味甘者為上品，名鐵皮鮮斛，價亦較貴。”[2]鐵皮石斛不僅具有較高的生態價值，而且具有較高的藥用價值。《中國藥典》一部(2015版)收載石斛質量標準，并將“鐵皮石斛標準”單獨列出[3]。近年大量藥理實驗表明，鐵皮石斛具有增強免疫力、抗氧化、抗疲勞、降血糖、護肝等作用[4-10]。隨著社會經濟的發展、人們生活水平的改善、人們對健康認知的加深及人們對鐵皮石斛功效認知的不斷提升，鐵皮石斛產品走進千家萬戶。過去鐵皮石斛的產品多以鐵皮石斛、鐵皮楓斗、切片、寸金條等原料產品為主，現如今市場需求的擴大給鐵皮石斛的發展帶來了機遇。截至2019年2月，已獲得國家批準的鐵皮石斛相關產品包括鐵皮石斛膠囊、鐵皮石斛顆粒、鐵皮楓斗晶等99種[11]。在新的發展機遇下，需要不斷豐富鐵皮石斛的產品形態。

破壁粉：細胞經破壁粉破壁后更容易被人體吸收到其有效成分，提高利用率。破壁技術的興起，為鐵皮石斛的深加工提供了一種新的思路。接下來需要研究：哪些因數對鐵皮石斛破壁粉的生產工藝有影響，鐵皮石斛破壁粉生產工藝如何影響鐵皮石斛質量參數[12-13]。本研究進行了相關探索，報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

鐵皮石斛采摘于云南龍陵，經昆明植物研究所楊青松副研究員鑒定為蘭科植物鐵皮石斛。鐵皮石斛植株洗凈后，將莖切斷，于60 ℃恒溫干燥，干燥過程中不間斷用快速水分測定儀測定鐵皮石斛干料的含水量，將含水量為2%、4%、6%、8%、12%、14%時的樣品各取出5 kg；取含水量為12%的干料200g用普通粉碎機進行打粉，全部通過3號篩作為對照樣品。D-甘露糖對照品(中檢院)(99.4%)，D-無水葡萄糖對照品(中檢院)(99.9%)；DL-鹽酸氨基葡萄糖(中檢院)(100.0%)；色譜純甲醇(默克)、色譜純乙腈(默克)、(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)PMP(西格瑪)、苯酚、硫酸、無水乙醇、甲醇、氫氧化鈉、鹽酸、三氯甲烷等試劑均為國藥分析純、娃哈哈純凈水。

1.2 主要儀器

島津電子分析天平(SHIMADZU)；島津紫外可見分光光度計(UV-1900型)；島津(LC2030)高效液相色譜儀；恒溫干燥箱；恒溫水浴鍋；離心機；沃特斯(waters)高效液相色譜柱(型號C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)、鹵素水分測定儀(SHIMADZU)、振動式細胞級超微粉碎機(XDW-15B)。

2 方法

2.1 醇溶性浸出物測定

參照《中國藥典》一部2015版鐵皮石斛醇溶性浸出物測定方法[3]，以95%乙醇為溶劑測定鐵皮石斛醇溶性浸出物。

取鐵皮石斛樣品約3 g，并精密稱定，將鐵皮石斛置250 mL的錐形瓶中，精密添加95%乙醇100 mL，密塞，精密稱定重量，靜置1 h，采用冷凝管回流法，加熱至沸騰，并保持1 h。放冷至室溫，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用95%乙醇補足減失的重量，混勻，過濾，濾液精密量取25 mL，置于干燥至恒重的蒸發皿中，在水浴上蒸干后，在105 ℃干燥箱中干燥3h，置干燥器中冷卻30 min，快速精密稱定重量。以鐵皮石斛干燥品計算醇溶性浸出物的含量(%)。

M1為蒸發皿重量，M2為蒸發皿恒重后重量，M3為鐵皮石斛重量，M4為蒸發皿和鐵皮石斛重量，M5為蒸發皿和鐵皮石斛干燥恒重后重量，X為干燥失重。

2.2 多糖含量測定

參照《中國藥典》一部2015版鐵皮石斛多糖含量測定方法[3]，以葡萄糖標準品為對照品，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量[14]。

2.2.1 對照品溶液制備方法 精密稱定無水葡萄糖對照品0.022 53 g，置于200 mL容量瓶中，用純化水定容至200 mL所得溶液含葡萄糖為90.1 μg/mL。

2.2.2 標準曲線繪制方法 用移液槍精密量取葡萄糖對照品溶液0.2 mL、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL，分別置10 mL具塞比色管中，分別加純化水補至1.0 mL，精密量取5%苯酚溶液(臨用配制)1 mL，混勻，再精密加硫酸5 mL，混勻，放入沸水中加熱20 min，取出，放入冰水混合物中冷卻5 min，空白試樣的制備用純化水替代葡萄糖對照溶液，在488 nm的波長處測定吸光度(A)。以吸光度(A)為縱坐標(Y)，葡萄糖質量分數為橫坐標(X)，繪制標準曲線，得回歸方程為Y=17.60X-0.118(R2=1.000 0)。

2.2.3 鐵皮石斛樣品的制備方法 取鐵皮石斛(過3號篩)粉末約0.3 g，精密稱定，精密加入純化水200 mL，回流加熱2 h，放冷至室溫，將其全部轉移至250 mL量瓶中，并少量多次用純化水洗滌一并轉入容量瓶中，用純化水定容至刻度并搖勻、過濾，精密量取濾液2 mL，放入15 mL離心管中，精密加入無水乙醇10 mL，搖勻冷藏1 h后取出，在轉速為4 000 r/min離心20 min，將上清液棄去，所得沉淀加80%乙醇8 mL，共洗滌2次，離心，棄去上清液，沉淀用熱水溶解，轉移至25 mL容量瓶中，放冷至室溫，加純化水至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 樣品測定方法 精密量取鐵皮石斛供試品溶液1 mL，置于10 mL具塞比色管中，按照鐵皮石斛標準曲線的制備方法制備樣品，測定吸光度(A)，用繪制的標準曲線計算葡萄糖的量，即得多糖含量。

2.3 甘露糖含量測定

參照《中國藥典》一部2015版鐵皮石斛甘露糖含量測定方法[3]，以甘露糖標準品為對照品，采用甘露糖衍生物法測定甘露糖含量[16-18]。

2.3.1 色譜分析條件及系統適用性條件 以乙腈(C2H3N)-0.02mol/L的乙酸銨(C2H7NO2)溶液20∶80為流動相，沃特斯(Waters)高效液相色譜柱(型號C18，5 μm，4.6 mm×250 mm)；在250nm波長檢測條件下。理論塔板數應不低于4 000(按甘露糖峰計算)。

2.3.2 校正因子測定 精密稱定DL-鹽酸氨基葡萄糖1.200 05 g，置于100 mL容量瓶中，加純凈水使溶解并定容至刻度，搖勻得含DL-鹽酸氨基葡萄糖含量為12.000 5 mg /mL的溶液，作為內標溶液。精密量取內標溶液1 mL和精密稱定D-甘露糖對照品0.010 2 g，置于100 mL容量瓶中，加入純凈水適量，使溶解并稀釋至刻度，搖勻，量取400 μL，加入1-苯基-3-甲基-5-P比唑啉酮(PMP)甲醇溶液(0.5 mol/L)與氫氧化鈉溶液(0.3 mol/L)各400 μL，搖勻，于70 ℃恒溫水浴鍋中反應100 min。再加鹽酸溶液500 μL(0.3 mol/L)，搖勻，用三氯甲烷(分析級)2 mL/次洗滌3次，棄去三氯甲烷層，水層在轉速為4 000 r/min離心5 min，取上清液1 mL于樣品瓶中，10 μL注入高效液相色譜儀，測定，計算校正因子。

表1 校正因子測定

2.3.3 鐵皮石斛樣品測定法 取鐵皮石斛粉末(過3號篩)約0.12 g，精密稱定，以80%乙醇為溶劑，索氏提取中加熱回流4 h，取出藥渣并揮干乙醇，將濾紙和藥渣置于燒杯中，加水100 mL，再精密加入DL-鹽酸氨基葡萄糖內標溶液2 mL，煎煮并持續攪拌1 h，放至室溫，在100 mL容量瓶中定容至刻度，搖勻，離心，精密量取上清液1 mL，置于頂空瓶中，加鹽酸溶液0.5 mL 3.0 mol/L，封口，混勻，在110 ℃恒溫干燥箱中水解1h，放至室溫，用氫氧化鈉溶液(3.0 mol/L)調節pH值至中性，精密量取400 μL，照校正因子測定方法制備，自“加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液”起，操作結束后，取上清液注入高效液相色譜儀，測定，即得。

2.3.4 陰性對照樣品 取純凈水400 μL，依據校正因子測定方法，從“加0.5 mol/L的PMP甲醇溶液”開始操作，可得。

2.3.5 精密度測試 吸取供試品溶液，按照甘露糖含量測定方法中的色譜條件，進樣6次，測定甘露糖的含量，計算結果RSD=0.78%。

2.3.6 穩定性測試 吸取供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h時，按照甘露糖含量測定方法中的色譜條件，測定甘露糖的含量，計算結果RSD=0.94%，說明甘露糖的衍生物在24 h內穩定。

2.3.7 重復性測試 取相同來源藥材，按照甘露糖含量測定方法平行制備供試品溶液6份，按照甘露糖含量測定色譜條件分別進樣，檢測甘露糖的含量，計算結果RSD=1.78%(n=6)。

2.3.8 加樣回收測試 精密稱取已知甘露糖含量的鐵皮石斛樣品6份，準確加入相同量的標準品(甘露糖)，按照甘露糖含量測定的方法，制備供試品溶液，測定結果回收率為99.60%，RSD為1.75%。

表2 加樣回收試驗結果

2.4 甘露糖與葡萄糖峰面積比測定

參照《中國藥典》一部2015版鐵皮石斛中甘露糖/葡萄糖峰面積比測定方法進行測定。取D-無水葡萄糖對照品精密稱定0.010 04 mg，置于200 mL容量瓶中，加純凈水使溶解并定容至刻度得D-無水葡萄糖50 μg/mL的對照品溶液。按照甘露糖含量測定方法測定，計算甘露糖/葡萄糖峰面積比值。

3 樣品含量測定

3.1 鐵皮石斛含水量對鐵皮石斛破壁粉工藝和質量的影響

取含水量為2%、4%、6%、8%、12%、14%鐵皮干料各200g，在振動式細胞級超微粉碎機(XDW-15B)-15 ℃條件下粉碎30 min。取出樣品分別編號，分別按“2”下項方法制備供試品并計算測定，不同樣品測定分析及計算結果見表3。

表3 鐵皮石斛含水量對鐵皮石斛破壁粉工藝及質量參數的影響

由表3可知：普通粉碎機與振動式細胞級超微粉碎機對鐵皮石斛粉碎后，對甘露糖含量測定結果無影響；對浸出物、多糖、甘露糖與葡萄糖峰面積比測定結果差異顯著。振動式細胞級超微粉碎機在相同的粉碎溫度(-15 ℃)、粉碎時間(30 min)的條件下對不同含水量的鐵皮石斛粉碎測定結果表明：甘露糖的相對標準偏差(1.6%)<多糖的相對標準偏差(7.8%)<浸出物的相對標準偏差(11.9%)<甘露糖與葡萄糖峰面積比的相對標準偏差(31.7%)。甘露糖含量的測定結果與鐵皮石斛含水量沒有關系；浸出物含量隨著鐵皮石斛含水量的降低而升高；多糖測定結果隨著水分的降低而增加；浸出物隨著水分的降低而增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比隨著水分的降低而降低。

3.2 鐵皮石斛粉碎時間對鐵皮石斛破壁粉工藝和質量的影響

取含水量6%鐵皮干料1 200 g平均分成6份，在振動式細胞級超微粉碎機(XDW-15B)-15 ℃條件下粉碎5 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min。取出樣品分別編號，分別按“2”項方法制備供試品并計算測定，不同樣品測定分析及計算結果見表4。

表4 鐵皮石斛粉碎時間對鐵皮石斛破壁粉工藝及質量參數的影響

由表4可知：普通粉碎機與振動式細胞級超微粉碎機對鐵皮石斛粉碎后，對甘露糖含量測定結果無影響；對浸出物、多糖、甘露糖與葡萄糖峰面積比測定結果差異顯著。振動式細胞級超微粉碎機在相同的粉碎溫度(-15 ℃)、含水量(6%)的條件下對鐵皮石斛粉碎不同粉碎時間測定結果表明：甘露糖的相對標準偏差(2.3%)<多糖的相對標準偏差(8.6%)<浸出物的相對標準偏差(13.0%)<甘露糖與葡萄糖峰面積比的相對標準偏差為(32.4%)。甘露糖含量的測定結果與鐵皮石斛粉碎溫度沒有關系；浸出物含量隨著鐵皮石斛粉碎溫度的降低而升高；多糖測定結果隨著粉碎溫度的降低而增加；浸出物隨著粉碎溫度的降低而增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比隨著粉碎溫度的降低而降低。

3.3 鐵皮石斛粉碎溫度對鐵皮石斛破壁粉工藝和質量的影響

取含水量6%鐵皮石斛干料1 200 g平均分成6份，在振動式細胞級超微粉碎機(XDW-15B)溫度為25 ℃、15 ℃、5 ℃-5 ℃、-15 ℃、-25 ℃的條件下粉碎30 min。取出樣品分別編號，分別按“2”項方法制備供試品并計算測定，不同樣品測定分析及計算結果見表5。

表5 鐵皮石斛粉碎溫度對鐵皮石斛破壁粉工藝及質量參數的影響

由表5可知：普通粉碎機與振動式細胞級超微粉碎機對鐵皮石斛粉碎后，對甘露糖含量測定結果無影響；對浸出物、多糖、甘露糖與葡萄糖峰面積比測定結果差異顯著。振動式細胞級超微粉碎機在相同的粉碎時間(30 min)、含水量(6%)的條件下對鐵皮石斛粉碎不同粉碎溫度測定結果表明：甘露糖的相對標準偏差(1.3%)<多糖的相對標準偏差(7.6%)<浸出物的相對標準偏差(10.3%)<甘露糖與葡萄糖峰面積比的相對標準偏差為(28.9%)。甘露糖含量的測定結果與鐵皮石斛粉碎溫度沒有關系；浸出物含量隨著鐵皮石斛粉碎溫度的降低升高；多糖測定結果隨著粉碎溫度的降低增加；浸出物隨著粉碎溫度的降低增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比隨著粉碎溫度的降低而降低。

4 討論

鐵皮石斛在振動式細胞級超微粉碎機粉碎所得粉的質量參數隨著鐵皮石斛粉碎的工藝參數含水量、粉碎時間、粉碎溫度的影響而變化。粉碎的工藝參數對甘露糖含量的測結果沒有影響；浸出物、多糖隨著含水量的降低而增加、粉碎時間的增加而增加、粉碎溫度的降低而增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比隨著含水量的降低而減小、粉碎時間的增加而減小、粉碎溫度的降低而減小。可以看出：鐵皮石斛含水量、粉碎時間、粉碎溫度是鐵皮石斛破壁粉生產工藝的關鍵工藝參數，含水量越低、粉碎時間越長、粉碎溫度越低越有利于鐵皮石斛破壁；但當含水量小于等于8%、粉碎時間超過30 min、溫度低于-5 ℃時影響趨于穩定。

鐵皮石斛經過振動式細胞級超微粉碎機粉碎后甘露糖含量保持不變；浸出物、多糖測定結果增加；甘露糖與葡萄糖峰面積比減小，說明鐵皮石斛粉碎工藝對鐵皮石斛質量參數有顯著影響。

鐵皮石斛經過破壁粉碎后質量參數差異顯著，有效成分多糖、浸出物含量增加，破壁后多糖有效成分更有利于溶解出來，甘露糖含量保持一致，破壁粉浸出物升高使得葡萄糖含量增加，從而導致甘露糖與葡萄糖峰面積減小。鐵皮石斛的有效成分主要為糖類，鐵皮石斛的破壁對檢測結果影響顯著。

本研究結果與《中國藥典》一部(2015版)記載相符，但鐵皮石斛原料經過破壁處理后，浸出物、多糖、甘露糖/葡萄糖峰面積比檢測指標發生了顯著變化；更多的有效成分被溶解檢出，說明對鐵皮石斛進行破壁深加工處理的研究有實際應用價值。后期仍需對破壁粉的深加工工藝和質量標準進行深入研究。醇溶性浸出物、多糖及甘露糖/葡萄糖峰面積比可作為研究鐵皮石斛破壁粉工藝研究和工藝優化的檢測指標。