從水通道蛋白4探討附子理中湯溫陽健脾祛濕的作用?

王露瑤，寧晚玲,2，唐漢慶△，王有科，李克明

(1. 右江民族醫學院,廣西 百色 533000； 2. 廣西中醫藥大學, 南寧 530001)

結直腸癌是常見的腫瘤，有胃腸道腹瀉及中性粒細胞減少癥等骨髓抑制表現，是結直腸癌化療常見的毒副作用[1-2]。中藥在癌癥治療中起到減輕化療或放療副作用，在提高癌癥患者生存質量等方面具有一定的優勢[3]。附子理中湯有溫脾腎陽、健脾祛濕止瀉作用。中醫理論認為“腎脾為先后天之本”，且“脾為氣血生化之源”，所以該方是針對胃腸道腹瀉及中性粒細胞減少癥化療副作用的適用方劑。

附子理中湯由理中湯加附子組成，針對脾腎陽虛癥見吐、利、痛、脹、手足逆冷等癥狀，是溫陽健脾的常用方劑。附子理中湯溫陽健脾功效表現廣泛，研究表明其對于能量及物質代謝[4]、機體產熱過程[5]、胃腸動力學[6]均有良性調控作用。對于脾陽虛衰引起的腹瀉、水腫等病變，采用溫脾腎陽、健脾利水治法已得到實踐證明，但其溫陽健脾祛濕的分子生物學機制仍然需要更多的實驗研究。本實驗工作通過建立大鼠脾陽虛模型，采用附子理中湯作為干預藥物，觀察其對陽虛腹瀉的改善作用，從水通道蛋白4功能作用探討附子理中湯對于胃腸道腹瀉的起效機理。

1 材料

1.1 動物

清潔級Wistar大鼠120只，雌雄不拘，體質量(174± 10)g，由右江民族醫學院科學實驗中心提供，合格證號SCXK(桂)2017-0003，常規飼養，適應環境1周后開始實驗。

1.2 試劑與藥物

Real-time PCR試劑盒(北京天根生化科技有限公司)；ANP、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α、SCr、BUN、UCr試劑盒(Abcam公司)；炮附子、黨參、白術飲片(北京同仁堂科技發展股份有限公司)；干姜(康美藥業股份有限公司)；炙甘草(貴州同濟堂制藥有限公司)。

1.3 儀器

Real-time PCR儀(美國伯樂公司)；酶標儀(Thermo Labsystem 公司)；紫外分光光度儀(Beckman公司)；超低溫冰箱(日本三洋公司)；電子天平(瑞士Mettler公司)；電動玻璃勻漿機(寧波新芝公司)；高速低溫離心機(ALC公司)。

2 方法

2.1 動物分組及造模

清潔級Wistar大鼠120只，隨機分為空白對照組(對照組)、假手術組、模型組和附子理中湯高、中、低劑量組共6組各20只。模型組高、中、低劑量組采用“肩胛骨間棕色脂肪組織(brown adipose tissue, BAT)切除術+高脂飼料喂養+隔日寒冷環境刺激”方法造模，假手術組只找到BAT但不切除，術后均第 1 天開始喂高脂飼料共30 d。高、中、低劑量各組分別按照每天40、20、10 g/kg以附子理中湯灌胃，附子理中湯給藥劑量根據參考文獻[7]按照臨床人用劑量通過體表面積法換算為大鼠劑量。其余各組給予等體積的生理鹽水灌胃，均連續干預30 d，模型組于造模成功后第1天取材，其余各組與給藥組在第30天末次干預或灌藥后取材。造模制備評判標準參考文獻[8-9]中的脾陽虛“陽虛癥狀群”和“消化不良癥狀群”?！瓣柼摪Y狀群”包括形寒、肢冷、倦怠、消瘦等，“消化不良癥狀群”包括腹瀉、納呆、腹痛等。通過行為學觀察，注意到模型動物喜扎堆、蜷伏懶動、毛色枯槁、稀便、肛周污穢、喂飼量減少等，與上述文獻描述的癥狀相似。

2.2 附子理中湯制備

按照2015版《中國藥典》附子理中湯，由炮附子、黨參、白術、干姜、炙甘草按照3∶5∶4∶3∶2比例組方。經右江民族醫學院藥理教研室鑒定，附子為毛茛科植物烏頭的子根，黨參為桔?？浦参稂h參的干燥根，白術為菊科植物白術的干燥根，干姜為姜科植物姜的干燥根莖，甘草為烏拉爾甘草的根。按比例稱取藥材，各藥蒸餾水浸泡12 h，炮附子先煎1 h后納入其余諸藥煎煮40 min，紗布濾除藥液，余渣加適量水繼續煎煮40 min，紗布濾除藥液，合并2次濾液，水浴加熱濃縮制備成濃度為含生藥量2 g/mL的藥液，4 ℃冰箱保存待用。

2.3 回腸組織觀察

取回腸組織4% 多聚甲醛固定24 h，常規石蠟包埋，切片厚度5 μm， 60 ℃烤箱中烘烤30 min，二甲苯、無水酒精以及95%酒精、 80%酒精、70%酒精及三蒸水脫蠟及水，蘇木精-伊紅 (HE) 染色，甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡觀察回腸組織變化。

2.4 AQP4 mRNA表達

表1示，Real-time PCR檢測。取結腸組織50 mg加入冷凍Trizol 2 mL，研磨器中仔細研碎并勻漿放入EP管，20 ℃孵育5 min，加入氯仿0.4 mL，旋緊蓋子用力搖動15 s，20 ℃孵育3 min，4 ℃離心15 min(12000 r/min)，取上清液至新的EP管，加0.5 mL異丙醇，20 ℃孵育樣品10 min，4℃離心10 min(12000 r/min)，棄上清液，75%乙醇洗滌沉淀1次，4 ℃離心5 min(7500 r/min)，棄乙醇真空干燥5 min，加DEPC處理水溶解RNA，-80 ℃保存備用。取適量RNA溶液按照逆轉錄試劑盒說明逆轉錄合成cDNA。對逆轉錄產物進行PCR擴增反應，并以GAPDH為內參。PCR反應條件為94 ℃ 30 s預變性，95 ℃ 5 s 40次循環變性，61 ℃ 30 s延伸，55 ℃ 30 s 81次循環退火，72 ℃ 10 min穩定產物，4 ℃ 60 min保存。AQP4基因引物由生物公司代為設計合成。

表1 RT-PCR引物序列

取適量PCR擴增反應產物進行瓊脂糖電泳，經凝膠成像系統讀取目的基因灰度值，以目的基因灰度值/ GAPDH基因灰度值的比值為目的基因mRNA的相對表達量。

2.5 ANP含量、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平及SCr、BUN、 UCr含量檢測

腹主動脈取血5 mL，血液靜置0.5 h，4℃離心10 min(2500 r/min)，留取血清-70 ℃ 凍存待檢。采用ELISA法檢測ANP含量、IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平，常規生化法檢測SCr、BUN、 UCr含量，嚴格按照操作說明進行。

2.6 統計學方法

3 結果

3.1 回腸組織形態學

圖1示，對照組與假手術組回腸組織結構完整，層次分明，界限清晰，未見水腫，回腸黏膜皺襞完整；模型組可見回腸組織結構完整，但界限邊緣不整甚至模糊，多處可見水腫，染色淺淡，局部可見回腸絨毛變矮或消失，炎細胞浸潤；低劑量組和中劑量組具體情況大致同模型組未見明顯改善；高劑量組較模型組明顯改善，與對照組和假手術組基本接近，組織結構完整，界限明顯清晰，局部固有層輕度水腫，間質較為疏松，回腸黏膜皺襞較完整，未見異常病變，黏膜上皮細胞與腺體分布正常，炎細胞浸潤減輕。

注：A.對照組；B.模型組；C.假手術組；D.劑量組；E.劑量組；F.低劑量組圖1 各組回腸組織形態學變化比較(HE，×200)

3.2 各組炎癥因子IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平比較

表2示，與對照組比較，模型組IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高(P<0.05，P<0.01)；與模型組比較，中、高劑量組IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均下降(P<0.05，P<0.01)。

表2 各組炎癥細胞因子水平比較

3.3 各組ANP含量、AQP4 mRNA表達、SCr、BUN和UCr含量比較

表3示，與對照組比較，模型組ANP含量、AQP4 mRNA表達均降低(P<0.05，P<0.01)，SCr、BUN、UCr含量均升高(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，中、高劑量組ANP含量、AQP4 mRNA表達均升高(P<0.05，P<0.01)，各劑量組SCr、BUN、UCr含量均有不同程度的減低(P<0.05，P<0.01)。

表3 各組ANP含量、AQP4 mRNA表達、SCr、BUN和UCr含量比較

4 討論

腹瀉屬于中醫學 “泄瀉”“饗瀉”范疇?！端貑枴り庩枒蟠笳撈分赋觯骸扒鍤庠谙拢瑒t生饗泄; 濁氣在上，則生月真脹”?！峨y經》也認為： “濕多成五泄”，腹瀉的形成與水濕、痰濁內停密切相關。“脾主運化”是“脾”的生理功能之一。一方面，脾通過運化水谷精微發揮營養、滋潤全身的作用；另一方面，又通過運化水濕、痰濁之邪保持機體水液代謝平衡，避免水濕、痰濁之邪內停。因此，《素問·至真要大論篇》指出：“諸濕腫滿，皆屬于脾”，認為水濕內停、泄瀉水腫等均屬于脾“運化”功能失常的表現?！捌⒅鬟\化”生理功能的發揮，有賴于“脾陽升清”作用。如果脾陽虛衰、清陽不升則脾運化功能減弱，水濕停聚，下迫為泄瀉。正如《素問·陰陽應象大論篇》所言：“故清陽為天，濁陰為地……故清陽出上竅，濁陰出下竅”，表明脾陽虛衰是腹瀉發生的重要病機。針對腹瀉發生的脾陽虛衰病機，《素問·至真要大論篇》提出：“高者抑之,下者舉之”的治療大法。李東垣也指出：“脾宜升則健”，主張采用溫運脾陽法達到升脾陽止瀉的目的。腎陽為人身元陽，慢性腹瀉久瀉易致腎陽不足，腎陽虛則不能溫煦脾陽。本實驗工作采用附子理中湯作為脾陽虛證干預藥物，是為振奮、鼓舞腎陽進而溫煦脾陽以加強溫陽之力。

AQP4是水通道蛋白家族之一，是維持水液平衡的重要分子。研究表明，上調大鼠胃腸道AQP4 含量和 AQP4 mRNA表達， 能促進胃腸道黏膜對水的重吸收[10]。課題以往研究表明，ANP促進結腸對水、氯化鉀的吸收，從而改善脾陽虛大鼠腹瀉癥狀，AQP4可通過AQP4-ANP-pGC-cGMP信號傳導途徑調節水液代謝[11]。而最近研究表明，AQP4尚可減輕炎癥反應，緩解腹痛腹瀉癥狀[12-13]。因此，AQP4既可促進胃腸道黏膜對水的重吸收(表現為祛濕作用)，也可減輕炎癥反應(表現為健脾作用)，對于脾陽虛腹瀉是一個重要的治療靶點。本實驗中注意到，附子理中湯能上調AQP4 mRNA表達和ANP含量。胃腸組織形態學也觀察到，各劑量組水腫與炎癥細胞浸潤狀況也有不同程度改善，改善程度與劑量有關，以高劑量明顯，提示臨床需要重視劑量的使用問題。

關于本實驗工作取材的時間節點，模型組于造模成功后第1天取材，其余各組與給藥組在第30 天末次干預或灌藥后取材。這是考慮到脾陽虛證包含的許多現代疾病屬于慢性疾病范疇，慢性病一般都存在機體自身的自我愈合、自我適應的演變進程，為得到實時的脾陽虛證指標檢測結果，故選取造模成功后取材檢測。由于脾陽虛證所屬的許多慢性病臨床治療?？吹叫枰胤街委煟ㄙM的時間可能較長，因此給藥組選取第30 天末次灌藥后取材，對于此種考慮尚請學界同仁批評指正。

本實驗中，模型組炎癥細胞因子IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均升高，而采用附子理中湯干預后，IL-8、IL-6、IL-1β、TNF-α水平均下降，與研究[14-16]的報道一致，提示附子理中湯可能通過影響AQP4進而減輕炎癥反應。

SCr、BUN、UCr含量常常用于檢測腎功能。報道表明，SCr、BUN、UCr作為早期傳統的檢測腎功能指標，對于發現腎功能早期改變具有較好的參考價值[17-18]。 SCr、BUN、Ucr過多在體內蓄積在中醫學視為腎陽氣化功能的不足[19]，《黃帝內經》已指出陽氣在人體主要發揮溫養、氣化、防御等功能，由于脾腎陽虛不能蒸水化氣、分清泌濁，致代謝產物SCr、BUN、Ucr水濕濁邪泛濫、潴留體內，有學者通過溫補脾腎陽以啟水助氣化改善腎功能不全[20-21]。本實驗中，模型組SCr、BUN、UCr含量升高，提示腎陽蒸騰氣化功能減弱，而附子理中湯各劑量組SCr、BUN、UCr含量均有不同程度減低表現為“溫陽”作用。

本實驗工作結果提示，附子理中湯影響AQP4表達，進而通過AQP4作用，一方面減輕胃腸組織炎癥反應，另一方面經由ANP途徑調控水液代謝，從而發揮其溫陽健脾祛濕作用。