瀉肝安神方調節血清與杏仁核炎癥反應改善肝郁火化證焦慮大鼠行為學的實驗研究?

趙振武，郭蓉娟，顧麗佳，史華偉，鄧瀟斐，郭 曉，袁清潔，郭建友

(1. 北京中醫藥大學第三附屬醫院，北京 100029；2.北京中醫藥大學東方醫院，北京 100078； 3. 中國科學院心理研究所，北京 100101； 4. 北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700； 5. 北京市中西醫結合醫院，北京 100096)

焦慮癥是臨床常見神經癥亞型，已成為突出的公共衛生問題。西藥治療廣泛性焦慮障礙(GAD)效果肯定，但部分患者因不良反應求助于中醫藥。先前專家采用臨床流行病學方法，在多中心、大樣本量基礎上運用貝葉斯網絡技術和聚類分析方法明確肝郁化火是GAD的六大基本證型之一[1]。郭蓉娟等認為疏肝瀉火養血安神法是符合此證的常用治法[2]，方隨法出，由靜心安神湯化裁成瀉肝安神方[3]，其療效好、不良反應少、服用方便，但效應機制有待闡明。

心理生理學理論認為，焦慮是遺傳與環境因素作用的產物，相關因素還包括營養過剩、氧化應激和炎癥[4]。特別是應激性焦慮，炎癥是公認一致的因素[5]和潛在病因[6]。發現炎癥和精神疾病的新途徑之后[7-8]，外周免疫系統和大腦之間的相互作用被持續評估[9]。其中促炎細胞因子依然是調節心理神經免疫學的主要生物活性物質[10]。公認影響行為的2種外周炎癥細胞因子為IL-1β和TNF-α[11-12]，而抗炎細胞因子未被揭示。基于此，本研究進一步探討瀉肝安神方對肝郁化火焦慮大鼠行為學及血清和杏仁核炎癥因子的影響，明確焦慮的免疫調控失常情況及瀉肝安神方效用環節。

1 材料

1.1 動物

SPF級健康8周齡雄性Wistar大鼠120只，體質量(200±10) g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，動物許可證號SCXK (京) 2012-0001。飼養于中國科學院心理研究所動物房，室溫控制在20～24 ℃，相對濕度50%～60%，光照節律12 L/12D (7∶00～19∶00)，提供充足飼料和水，保持安靜，定期清潔和消毒。預養1周內自由攝食飲水，每天接受3 min撫摸。

1.2 藥品與儀器及試劑

瀉肝安神方組成：炒棗仁、刺五加、夏枯草、羚羊角粉，由北京康仁堂藥業有限公司提供，配方顆粒由北京中醫藥大學東方醫院制劑室質量控制。鹽酸地西泮片，2.5 mg/片(北京益民藥業有限公司生產，國藥準字H11020898)。

AES-M02 型大鼠高架十字迷宮，安來軟件科技有限公司Experimental System實驗系統和Behavioral Software行為分析軟件V-Maze ver 1.0；XeyeAbaV3.2動物行為視頻分析系統，北京天鳴宏遠科技發展有限公司；明暗箱參照文獻方法[13]自制；EZStart Chromatography Data software；5415R型高速離心機，德國Eppendorf公司；JY99-IIIB型超聲波細胞破碎儀，寧波新芝科器研究所；Lambdal P40紫外可見光分光光度儀，美國PE公司。

2 方法

2.1 分組

適應性飼養7 d后根據高架十字迷宮測試結果均分成空白對照組、模型組、地西泮組、瀉肝安神方高、中和低劑量組各20只，組間行為學測試差異無統計學意義。應激第7天、14天每組隨機取10只進行行為學評估和取材檢測炎癥因子。

2.2 動物模型建立

依據林文娟和前期的經驗[14-15]，采用高架十字迷宮(elevated plus maze test，EPM)任務進行定期評估，除空白對照組外，其余各組單籠飼養且按照設定實驗程序給予不確定性空瓶飲水應激建立肝郁化火焦慮模型。定時喂水訓練7 d，早晚各給飲水10 min，其余時間不給水。于第8天晚21∶00～21∶10開始應激實驗，早晚2個時間段內給予隨機刺激，持續2周，造模同時藥物干預連續14 d。空白對照組定時自由攝食。應激第7天及第14天行為學測評，組間交叉進行。動物均提前2 h進入測試實驗室適應環境。

2.3 給藥方法

參考《藥理實驗方法學》，瀉肝安神方高、中、低劑量組分別以28、14、7 g·kg-1·d-1顆粒劑混懸液灌胃，地西泮組以4.5 g·kg-1·d-1混懸液灌胃，每天1次，連續14 d。其余2組給藥時間和途徑同前，以0.9%氯化鈉溶液代替藥液。

2.4 高架十字迷宮試驗

中藥各組給藥1 h后，地西泮組給藥0.5 h后，在8∶00～14∶00進行行為學測試。測試時將大鼠置于高架十字迷宮的中央區，頭朝開臂，紅外跟蹤記錄5 min內大鼠進入開臂與全程的運動路程和開臂內停留時間(以四肢全部入臂或出臂為標準)。以開臂與全程運動路程的百分比、開臂內停留時間與5 min的百分比作為抗焦慮的觀察指標。

2.5 曠場實驗

測試時，將單只大鼠放入清潔敞箱的邊緣區，視頻跟蹤分析系統自動記錄大鼠5 min 自發活動。動物運動軌跡跟蹤系統統計全程運動路程和中央區(內半徑33 cm的圓形區域)的停留時間。

2.6 明暗箱實驗

實驗開始時將大鼠置于明箱中央，頭朝暗箱，記錄5 min內進入明箱次數及停留時間。

2.7 炎癥因子測定

血清和腦組織杏仁核制備，-80℃凍存。將腦組織放在冰上，采用RIPA裂解液提取腦組織蛋白，BCA法測定蛋白濃度，-80℃凍存。

以酶聯免疫吸附法(ELISA)測定外周血清和杏仁核中的腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)及白介素-10(interleukin-10，IL-10)的含量，試劑購買于美國R&D公司，儀器為美國ThermoMultisk 3型酶標儀。按照試劑盒操作步驟執行。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 高架十字迷宮實驗、曠場實驗、明暗箱測試

表1～3示，第7天與空白對照組比較，模型組開臂運動路程百分比及停留時間百分比降低，運動路程增加，明區停留時間百分比減少(P<0.05)，14 d時改變顯著，進入明箱次數及明區停留時間百分比減少(P<0.01)；第14天與模型組比較，地西泮組開臂運動路程百分比及停留時間百分比升高，運動路程減少和中央區停留時間增加，進入明箱次數和明區停留時間百分比增加(P<0.05)；瀉肝安神高劑量組開臂停留時間百分比明顯升高，運動路程減少，進入明箱次數增加(P<0.05)，明區停留時間百分比顯著增加(P<0.01)。

表1 各組高架十字迷宮測試行為學比較[例(%)]

表2 各組曠場測試行為學比較

表3 各組明暗箱測試行為學比較

注：與空白對照組比較：▽P<0.05，▽▽P<0.01；與模型組比較：*P<0.05，**P<0.01圖1 各組血清炎癥因子比較

3.2 血清炎癥因子

圖1示，應激第7天與空白對照組比較，模型組IL-1β、TNF-α含量均增加(P<0.05)，第14天IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著增加(P<0.01)，IL-10含量顯著減少(P<0.01)。應激第14天與模型組比較，地西泮組IL-6、TNF-α含量均顯著減少(P<0.01)， IL-10顯著增加 (P<0.01)；瀉肝安神高劑量組減少IL-1β、IL-6含量(P<0.05)，顯著降低TNF-α含量(P<0.01)，增加IL-10含量(P<0.05)。

3.3 杏仁核炎癥因子

圖2示，應激第14天與空白對照組比較，模型組IL-1β、IL-6、TNF-α均明顯增加，IL-10含量顯著減少(P<0.01)。與模型組比較，地西泮組IL-6、TNF-α均顯著減少，顯著增加IL-10含量(P<0.01)；瀉肝安神高劑量組IL-1β、TNF-α減少， IL-10 增加(P<0.05)，在IL-6上中劑量組優于高劑量組。

注：與空白對照組比較：▽▽P<0.01；與模型組比較：*P<0.05圖2 各組杏仁核炎癥因子比較

4 討論

焦慮障礙人群終身患病率為13.6%～28.8%[16]，近年來呈上升趨勢，造成醫療資源的沉重負擔，導致自殺等嚴重社會問題。因此探索焦慮障礙的產生機制，尋求有效的藥物治療途徑已成為當前迫切需要解決的課題。中醫證型以氣郁化火多見，病位主要在肝心涉及脾腎，主要病機為肝氣郁而化火、耗傷陰血、血不養心、心神不寧致病[2]。治療以疏肝解郁、清肝瀉火、養血安神為主。瀉肝安神方是北京中醫藥大學東方醫院郭蓉娟教授的經驗方，療效與帕羅西汀片相當[17-18]，具體機制值得探討。

本課題重復前期實驗采用不確定性空瓶飲水應激仿照慢性焦慮情緒應激方式[15]，模擬郁怒日久化火的病理演變過程，通過行為學觀察及飲水量、體質量、爪紅r值比較以及以方測證佐證情緒應激14 d成功建立肝郁化火焦慮模型。以此為基礎，酶聯免疫吸附法(ELISA)測定外周血清和杏仁核中炎癥因子含量，探討焦慮癥的發病機制。應激14 d模型組較少進入及停留于開放臂中，曠場運動總路程增加，而中央區停留時間減少，進入明箱次數減少且停留時間顯著縮短，結合前期實驗表明模型成功建立。

近年來，一些研究趨向于精神疾病發生可能與免疫激活導致細胞因子分泌增多有關，即“細胞因子假說”[19]。本研究示模型組應激1周血清IL-1β和TNF-α含量略增加， 2周時TNF-α、IL-1β、IL-6含量升高，IL-10含量降低，即出現炎癥。杏仁核是調節動物情緒的核心區域，在焦慮癥發生過程中起決定性的作用[20-22]，炎癥因子結果與血清類似。應激導致促炎細胞因子釋放增加，抗炎因子被抑制，引起機體炎癥反應，瀉肝安神方可使炎癥反應趨向正常化。本方由炒棗仁、刺五加、夏枯草、羚羊角粉4味藥物組成，虛實兼顧，氣血并用，配伍精當，方小力專，共奏疏肝瀉火、養血安神之功，療效與調節炎癥有關。

焦慮與免疫功能的異常改變關聯。異常免疫狀態可引發焦慮[23]，焦慮患者存在免疫功能的改變[24]。GAD患者可能同時存在免疫功能的激活及抑制，表現為免疫功能紊亂[25]。細胞因子參與調節情緒和行為，在焦慮等精神疾病中發揮作用[26]。本研究第14天模型組促炎因子IL-1β、IL-6、TNF-α含量均顯著增加，抗炎因子IL-10含量明顯減少，即促炎因子和抗炎因子的平衡被打破，出現免疫功能紊亂，與臨床報道一致。地西泮與瀉肝安神方均能減少IL-6、TNF-α和增加IL-10含量，為共性抗焦慮機制。另外本方還能減少IL-1β含量，作用機制更廣。本方究竟是直接作用于免疫系統，或是通過中樞系統的作用進而引起免疫功能改變，其抗焦慮的物質基礎未明，有待進一步探討。