LV-GlyT2 siRNA對(duì)骨癌痛大鼠嗎啡耐受形成的影響*

徐偉，王健，丁卓峰，李珍，張潔

（1.湖南省婦幼保健院 麻醉科，湖南 長(zhǎng)沙 410008；2.中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 麻醉科，湖南 長(zhǎng)沙 410008）

癌痛是惡性腫瘤患者最常見(jiàn)的癥狀之一。許多的惡性腫瘤，如前列腺癌、乳腺癌、肺癌常伴有骨轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致嚴(yán)重的骨破壞和癌性疼痛，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[1-3]。嗎啡是目前臨床上用來(lái)治療中重度癌痛的常用藥物[4]。但長(zhǎng)期使用嗎啡會(huì)帶來(lái)許多不良反應(yīng)，如便秘、搔癢及嗎啡耐受等[5]。其中，嗎啡耐受是影響臨床上嗎啡使用最主要的不良反應(yīng)，目前其具體機(jī)制仍不明確[6-7]。甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體2（glycine transporter 2,GlyT2）是調(diào)控突觸間甘氨酸濃度的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體。既往研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射GlyT2 抑制劑或敲除GlyT2 可以減輕骨癌痛，并增強(qiáng)單次注射嗎啡的鎮(zhèn)痛效能[8]。但目前尚未有研究探尋抑制GlyT2 表達(dá)對(duì)大鼠骨癌痛嗎啡耐受的影響。本研究擬復(fù)制骨癌痛模型，使用慢病毒載體部分敲除GlyT2 表達(dá)，明確其對(duì)骨癌痛大鼠嗎啡耐受形成的影響。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Walker 256 乳腺癌細(xì)胞購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物公司。von Frey 纖維絲（美國(guó)Northcoast 公司），7370 型熱痛儀（意大利UGO 公司）。兔抗GlyT2 抗體（美國(guó)Abcam 公司），山羊抗兔辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記IgG二抗（美國(guó)Jackson 公司），GlyT2 siRNA 慢病毒載體（LV-GlyT2 siRNA）（上海吉?jiǎng)P基因化學(xué)技術(shù)有限公司）。

1.2 動(dòng)物模型的復(fù)制與分組

清潔級(jí)成年雌性SD 大鼠，體重180 ～220 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（湘）2019-0004。采用改良Yaksh 法進(jìn)行鞘內(nèi)置管[9]，將鞘內(nèi)置管成功的30 只大鼠隨機(jī)分為鞘內(nèi)注射生理鹽水組（NS 組）、鞘內(nèi)注射陰性對(duì)照病毒組（LVNC 組）及鞘內(nèi)注射GlyT2 siRNA 病毒組（LV-GlyT2 siRNA 組），每組10 只。參照MAO-YING 等[10]的方法復(fù)制骨癌痛模型，在大鼠左側(cè)后肢脛骨上段骨髓腔注入Walker 256 乳腺癌細(xì)胞10μl（4×105個(gè)/ml）。NS 組、LV-NC 組、LV-GlyT2 siRNA 組大鼠接種后第7 天分別鞘內(nèi)注射生理鹽水10μl，陰性對(duì)照病毒10μl（滴度1×109TU/ml），GlyT2 siRNA陽(yáng)性病毒載體10μl（滴度1×109TU/ml）。接種后第9 天開(kāi)始3 組大鼠均鞘內(nèi)注射嗎啡（湖北宜昌人福藥業(yè)，批號(hào)：H21022436），10μg/次，2 次/d，連續(xù)7 d。

1.3 疼痛相關(guān)行為學(xué)檢測(cè)

1.3.1 機(jī)械縮足閾值（mechanical withdrawal threshold,MWT）3 組大鼠分別在癌細(xì)胞接種前及接種后7 d 測(cè)定術(shù)側(cè)后肢MWT[11]。將von Frey 纖維絲垂直伸向大鼠后肢足底，當(dāng)大鼠出現(xiàn)抬足或舔足時(shí)，記錄von Frey 克數(shù)，每次間隔10 min。每組大鼠測(cè)定3 次，取最小值。

1.3.2 最大可能效能百分比（percent of the maximum possible effect,%MPE）3 組大鼠在嗎啡注射前，以及注射后1 d、3 d、5 d、7 d 測(cè)量大鼠熱痛閾甩尾潛伏期，并計(jì)算%MPE[12]。將大鼠尾部置于刺激儀輻射源正中，刺激儀輻射強(qiáng)度設(shè)為54℃，臨界值設(shè)為20 s，當(dāng)尾部甩動(dòng)時(shí)記錄時(shí)間。測(cè)量3 次取平均值，每次間隔10 min。以%MPE 表示嗎啡的鎮(zhèn)痛效能，%MPE=（效應(yīng)時(shí)間-基礎(chǔ)時(shí)間）/（臨界值-基礎(chǔ)時(shí)間）×100%。

1.4 Western blotting 檢測(cè)大鼠脊髓GlyT2 蛋白的表達(dá)

取大鼠脊髓腰膨大，加入預(yù)冷的RIPA 裂解液，離心后取上清液，利用BCA 法測(cè)量蛋白濃度，隨后將各組50μg 蛋白樣品上樣，在10% SDS-PAGE 凝膠中，80 V 恒壓電泳30 min，然后120 V 電泳60 min。隨后恒流280 mA，60 min 轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜成功后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入兔抗GlyT2 多克隆抗體（1∶400），兔抗Tublin 抗體（1∶2 000）4℃孵育過(guò)夜，第2 天用1% TBST 室溫洗膜后加入生物素標(biāo)記的山羊抗兔二抗（1∶5 000），室溫孵育1 h，清洗后用ECL 發(fā)光液進(jìn)行顯色。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，比較用單因素方差分析或重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，進(jìn)一步兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)結(jié)果

3 組大鼠在癌細(xì)胞接種前及接種后7 d 的術(shù)側(cè)后肢MWT 比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間的大鼠MWT 有差異（F=526.900，P=0.000）；各組大鼠癌細(xì)胞接種后術(shù)側(cè)MWT 均較接種前下降（P＜0.05），說(shuō)明骨癌痛模型復(fù)制成功。②3 組大鼠MWT 無(wú)差異（F=0.077，P=0.926）。③3 組大鼠MWT 變化趨勢(shì)無(wú)差異（F=1.796，P=0.185）。見(jiàn)表1。

3 組大鼠注射嗎啡后1 d、3 d、5 d、7 d 的%MPE比較，采用重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)的方差分析，結(jié)果：①不同時(shí)間點(diǎn)大鼠%MPE 有差異（F=575.280，P=0.000）。②3 組大鼠%MPE 有差異（F=19.461，P=0.000）。注射嗎啡后5 d 和7 d，LV-GlyT2 siRNA 組%MPE 高于其他兩組（P＜0.05），說(shuō)明鞘內(nèi)注射LV-GlyT2 siRNA可以緩解骨癌痛大鼠嗎啡耐受。③3 組大鼠%MPE變化趨勢(shì)有差異（F=15.25，P=0.000）。見(jiàn)表2 和圖1。

表1 3 組大鼠癌細(xì)胞接種前后術(shù)側(cè)后肢MWT 比較 （n=10，g，±s）

表1 3 組大鼠癌細(xì)胞接種前后術(shù)側(cè)后肢MWT 比較 （n=10，g，±s）

組別 接種前 接種后7 d NS 組 8.80±1.39 2.42±1.46 LV-NC 組 8.40±1.26 3.20±1.39 LV-GlyT2 siRNA 組 8.80±1.03 2.60±1.27

表2 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)%MPE 比較 （n=10，%，±s）

表2 3 組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)%MPE 比較 （n=10，%，±s）

組別 1 d 3 d 5 d 7 d NS 組 94.32±8.58 58.09±11.34 27.29±12.24 18.20±9.46 LV-NC 組 94.59±7.93 60.20±10.72 32.09±8.65 19.86±12.76 LV-GlyT2 siRNA 組 96.09±5.71 70.61±11.07 55.20±8.35 52.34±7.25

圖1 3 組大鼠%MPE 的變化趨勢(shì) （n=10，±s）

2.2 3 組大鼠GlyT2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較

嗎啡注射第7 天，3 組大鼠GlyT2 蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=53.880，P=0.000）；LV-GlyT2 siRNA 組低于LV-NC 組和NS組（P＜0.05）。見(jiàn)圖2。

圖2 3 組大鼠嗎啡注射后7 d 脊髓腰膨大GlyT2 蛋白的表達(dá)

3 討論

本研究結(jié)果表明，骨癌痛大鼠鞘內(nèi)注射LVGlyT2 siRNA 后脊髓GlyT2 表達(dá)下調(diào)，在給予嗎啡處理后的第5 天和第7 天，大鼠%MPE 較LV-NC 組及NS 組明顯升高，說(shuō)明鞘內(nèi)注射GlyT2 siRNA 慢病毒載體能夠延緩骨癌痛大鼠嗎啡耐受的形成。

GlyT2 是調(diào)節(jié)突觸間甘氨酸濃度的重要轉(zhuǎn)運(yùn)體，其可以將突觸間隙中的甘氨酸重新攝入突觸前囊泡，清除突觸間隙中的甘氨酸[13-14]。甘氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，在突觸可塑性形成及疼痛信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮重要作用[15-17]。甘氨酸在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用分為2 種：一種是與體內(nèi)甘氨酸受體結(jié)合，抑制神經(jīng)沖動(dòng)傳導(dǎo)；另一種是與NMDA 興奮性受體上的甘氨酸-B 位點(diǎn)作用，協(xié)同激活NMDA 受體，參與興奮性神經(jīng)傳遞[18-19]。研究發(fā)現(xiàn)，GlyT2 選擇性抑制劑如Org25543、ALX1393 及GT-0198 可以減輕神經(jīng)病理性疼痛[20-22]。最近有研究發(fā)現(xiàn)，鞘內(nèi)注射GlyT2 抑制劑或GlyT2 siRNA 可以緩解骨癌痛相關(guān)的痛覺(jué)異常及痛覺(jué)過(guò)敏，并且可以增強(qiáng)單次給予嗎啡的鎮(zhèn)痛效能[8]。本實(shí)驗(yàn)中骨癌痛大鼠鞘內(nèi)注射GlyT2 siRNA 慢病毒載體后GlyT2 表達(dá)下調(diào)，使用嗎啡處理后，大鼠%MPE值仍維持在50%以上，說(shuō)明抑制GlyT2 表達(dá)能延緩嗎啡耐受的形成。GlyT2 抑制劑有時(shí)難以透過(guò)血-腦屏障，且靶組織的滲透作用較弱，因此選擇操作簡(jiǎn)便、效果可靠的給藥方式保證GlyT2 表達(dá)下調(diào)或功能抑制是研究及臨床運(yùn)用的關(guān)鍵。慢病毒載體介導(dǎo)的LVGlyT2 siRNA 可以相對(duì)局限地作用于注射部位，能夠轉(zhuǎn)染多種神經(jīng)細(xì)胞，不良反應(yīng)少，并且單次注射后可以長(zhǎng)期且穩(wěn)定地發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[23-24]。由于慢病毒載體注射入大鼠體內(nèi)后一般4 d 或5 d 開(kāi)始產(chǎn)生作用，并在1 周左右達(dá)最大效應(yīng)，因此本研究選擇在接種癌細(xì)胞后第7 天通過(guò)鞘內(nèi)注射GlyT2 siRNA 慢病毒載體，以期在嗎啡發(fā)揮作用期間產(chǎn)生最佳效應(yīng)。

LV-GlyT2 siRNA 緩解嗎啡耐受的具體機(jī)制不明確，可能與增強(qiáng)甘氨酸能神經(jīng)沖動(dòng)有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)，給予GlyT2 抑制劑可以延長(zhǎng)脊髓X 板層神經(jīng)元中甘氨酸能IPSPs 的衰減時(shí)間[25]，提示GlyT2 抑制劑可以在感覺(jué)神經(jīng)元中促進(jìn)甘氨酸能神經(jīng)傳遞，其認(rèn)為抑制膠質(zhì)細(xì)胞或神經(jīng)元中甘氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體可以提高脊髓中甘氨酸濃度，并延長(zhǎng)甘氨酸能電位的持續(xù)時(shí)間。WHITEHEAD 等[26]通過(guò)微透析的方法發(fā)現(xiàn)，給予大鼠GlyT2 選擇性抑制劑可以提高大鼠脊髓腦脊液中的甘氨酸濃度。筆者將在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中測(cè)量脊髓腦脊液中的甘氨酸濃度，以明確LV-GlyT2 siRNA 緩解嗎啡耐受的具體機(jī)制。

綜上所述，大鼠鞘內(nèi)注射GlyT2 siRNA 慢病毒載體可延緩骨癌痛大鼠嗎啡耐受的形成。