子宮內膜癌中線粒體融合蛋白2的表達及其臨床意義*

接智慧，周巖，高翔，邵婷，張雪英

（1.山東第一醫科大學第二附屬醫院 婦產科，山東 泰安 271000；2.赤峰學院附屬醫院婦產科，內蒙古 赤峰 024000）

子宮內膜癌發病率僅次于宮頸癌，且有逐年上升的趨勢[1]。根據2014年我國腫瘤登記年報，子宮內膜癌的發病率在女性惡性腫瘤中居第9 位，且患病人群呈年輕化趨勢[2]，給患者和社會帶來沉重的負擔。雖然手術結合放療、化療及激素治療等方法使子宮內膜癌療效提高，但晚期患者療效仍較差[3]。因此，探討子宮內膜癌發生、發展的分子生物學機制，尋找治療新靶點成為研究熱點。近年來研究發現，線粒體融合蛋白2（Mitofusin 2,MFN2）在多種惡性腫瘤中存在差異表達，且與腫瘤患者的不良預后有關[4]。但MFN2 在子宮內膜癌中的表達及與預后的關系國內外報道較少，本研究采用免疫組織化學SP 法和qRTPCR 檢測MFN2 在子宮內膜癌組織、非典型增生組織和正常子宮內膜組織中的表達，分析MFN2 蛋白與子宮內膜癌臨床病理特征及預后的關系，為進一步探究MFN2 在子宮內膜癌發生、發展過程中的作用提供研究基礎，同時為子宮內膜癌的診斷和治療提供新策略。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2010年1月—2014年1月在山東第一醫科大學第二附屬醫院經病理診斷為子宮內膜腺癌后行手術治療的72 例患者標本作為子宮內膜癌組。其中，年齡30 ～71 歲，平均50.5 歲；病理類型：I型60 例，Ⅱ型12 例。依照2009年國際婦產科聯盟（Federation International of Gynaecology and Obstetrics,FIGO）分期標準，I、Ⅱ期41 例，Ⅲ、Ⅳ期31 例；分化程度：低分化21 例，中分化40 例，高分化11 例。另收集同期本院33 例子宮內膜非典型增生患者的內膜組織標本作為非典型增生組。其中，年齡32 ～68 歲，平均51.4 歲。收集同期本院20 例因宮頸上皮內瘤變Ⅲ級行全子宮切除術的正常子宮內膜組織標本作為正常子宮內膜組（包括增生期內膜組織11 例，分泌期內膜組織9 例）。其中，年齡38 ～50 歲，平均45.4 歲。此外，收集20 例正常子宮內膜、23 例非典型增生和40 例子宮內膜癌的新鮮組織，均在大體標本離體后30 min 內采集，立即放入液氮，然后轉入-80℃保存，行qRT-PCR 檢測。子宮內膜癌患者術前均未行放療、化療及介入等抗腫瘤治療，納入患者（子宮內膜癌、非典型增生、正常子宮內膜）術前均未行內分泌治療。本研究通過醫院倫理委員會批準，患者及其家屬知情同意。

1.2 方法

1.2.1 試劑與儀器鼠抗人MFN2 抗體購自美國Abcam 公司（貨號ab56889），免疫組織化學SP 試劑盒和DAB 顯色試劑盒購自福州邁新公司（貨號KIT-9730），蘇木精染色劑購自珠海貝索生物公司，Trizol 購自美國Invitrogen 公司，cDNA 逆轉錄試劑盒購自美國 Thermo Scientific 公司（貨號K1622），qRTPCR 檢驗試劑盒購自珠海莫納生物科技公司（貨號MQ00201），目的基因及內參基因引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。7500 型定量PCR 擴增儀（美國ABI 公司）。

1.2.2 免疫組織化學SP 法對正常子宮內膜、內膜非典型增生和子宮內膜癌組織中MFN2 的表達進行檢測。石蠟包埋組織后進行連續性切片，脫蠟至水后采用過氧化氫阻斷內源性過氧化物酶活性，室溫孵育10 min，PBS 沖洗3 次后蛋白粉封閉2 h，將兔抗人MFN2 抗體（1∶1 000）加入后，4℃過夜，復溫后滴加二抗（1∶400），室溫孵育30 min，加入辣根過氧化物酶或堿性磷酸酶標志物，室溫孵育10 min。PBS 沖洗后滴加DAB 顯色，復染、脫水、封片。鏡檢并拍照記錄。結果判定：MFN2 蛋白陽性表現為細胞質出現棕黃色顆粒。染色強度：無著色為0 分，淺黃色為1 分，棕黃色為2 分，棕褐色為3 分。陽性細胞比例：＜26%為1 分，26%～50%為2 分，＞50%為3 分。根據染色強度和陽性細胞比例乘積判定：得分≥5 分為高表達，＜5 分為低表達[5]。結果由2 名觀察者獨立閱片判定。

1.2.3 qRT-PCR采取Trizol 一步法提取組織中總RNA，紫外分光光度計測定RNA 濃度及純度（OD 260/OD 280比值1.8 ～2.0），按逆轉錄試劑盒說明書將RNA 逆轉錄成cDNA，置于-20℃冷凍保存備用。MFN2 正向引物：5'-AACCCGGTCAT CTAACCCGT-3'，長度20 bp；反向引物：5'-TACTCCA CTATCGTTCTCTATTGAG-3'，長度25 bp。GAPDH 正向引物：5'-ACGCCTGCGCACTCGCATG-3'，長度19 bp；反向引物：5'-TAGTCGGACTGAGTTACTGC-3'，長度20 bp。qRT-PCR 擴增體系為20μl，反應條件：95℃預變性5 min，95℃變性10 s，63℃退火20 s，72℃延伸20 s，共計40 個循環。每一樣本重復3 次。采用2-??Ct法對MFN2 mRNA 相對表達量進行定量分析。

1.3 隨訪

采用電話或者門診隨訪。隨訪時間為患者術后1 ～73 個月，中位隨訪時間42 個月，隨訪終點事件為患者死亡或者到達隨訪截止時間（2019年4月）。

1.4 統計學方法

數據分析采用SPSS 24.0 及GraphPrism 8.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用方差分析；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗，進一步兩兩比較用校正檢驗水準法（α=0.0125）；Kaplan-Meier 法繪制生存曲線，比較用Log-rank χ2檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 3 組MFN2 蛋白表達比較

MFN2 蛋白陽性表現為細胞質出現棕黃色顆粒（見圖1），在正常子宮內膜組、非典型增生組和子宮內膜癌組高表達率分別為85.0%、39.4%及20.8%（見圖2），經χ2檢驗，差異有統計學意義（P＜0.05），子宮內膜癌組低于非典型增生組和正常子宮內膜組（P＜0.05）。見表1。

圖1 3 組MFN2 蛋白表達情況 （SP 法×200）

圖2 3 組MFN2 蛋白免疫組織化學評分比較

表1 3 組MFN2 蛋白表達水平比較 例（%）

2.2 不同臨床病理特征子宮內膜癌患者的MFN2蛋白表達

子宮內膜癌組不同年齡、是否絕經及不同肌層浸潤深度的MFN2 蛋白高表達率比較，差異無統計學意義（P＜0.05）；而不同病理類型、不同分化程度、有無淋巴結轉移及不同FIGO 分期的MFN2 蛋白高表達率比較，差異有統計學意義（P＜0.05），病理類型Ⅱ型高于I型，低分化高于高分化，無淋巴結轉移高于有淋巴結轉移，FIGO 分期I、Ⅱ期高于Ⅲ、Ⅳ期。見表2。

2.3 MFN2 蛋白表達與子宮內膜癌患者預后的關系

72 例子宮內膜癌患者中，MFN2 高表達者57 例，低表達者15 例。經過5年隨訪，無患者失訪。Kaplan-Meier 法繪制的生存曲線結果顯示，高表達者的中位生存期為47 個月，低表達者的中位生存期為26 個月。MFN2 高表達組3年生存率為73.3%，5年生存率為33.3%；MFN2 低表達組3年生存率為38.6%，5年生存率為9.8%。兩組生存率比較，經Log-rank χ2檢驗，差異有統計學意義（χ2=7.077，P=0.008）。見圖3。

表2 不同臨床病理特征子宮內膜癌患者的MFN2 蛋白表達 例

圖3 子宮內膜癌患者生存曲線

2.4 3 組MFN2 mRNA 相對表達量比較

qRT-PCR 檢測結果顯示，MFN2 mRNA 在正常子宮內膜組、非典型增生組及子宮內膜癌組相對表達量分別為（2.200±0.234）、（1.063±0.158）及（0.622±0.119），經方差分析，差異有統計學意義（F=115.462，P=0.000），子宮內膜癌組較正常子宮內膜組、非典型增生組低（P＜0.05）。見圖4。

圖4 3 組MFN2 mRNA 相對表達量比較 （±s）

3 討論

子宮內膜癌是女性生殖系統常見惡性腫瘤之一，近30年來，其發病率逐年增加，且復發率和病死率較高[6]。盡管通過手術聯合放療、化療等綜合治療提高早期患者生存率，但是對晚期患者的治療難度仍較大，且病死率仍高居不下[7]。目前研究認為，子宮內膜癌是一種高度異質性的腫瘤，且多種危險因素可誘發子宮內膜癌，如高血壓、絕經狀態、不孕癥及家族史等[8]。關于其機制研究較多，但尚未有統一定論。因此，深入研究、闡明子宮內膜癌發病機制，尋找新的防治方法是目前子宮內膜癌研究的緊迫任務。

MFN2 由定位于chr 1p 36.22 的MFN2基因編碼，含757 個氨基酸殘基，錨定于線粒體外膜的U 型跨膜蛋白[9]。目前研究表明，MFN2 在維持線粒體正常形態、調節線粒體的新陳代謝及參與細胞信號傳導等生理功能方面有重要作用[10]。有學者研究指出，MFN2低表達與線粒體過度分裂有關，在癌細胞增殖、凋亡、代謝紊亂、細胞運動和遷移過程中起重要作用，并且可以激活固有的（線粒體）凋亡通路，而MFN2 高表達可通過抑制線粒體分裂調控細胞存活、耐藥[11]。MFN2 表現出多方面的作用，目前許多學者認為，MFN2 在腫瘤細胞的增殖、凋亡細胞自噬中有重要作用[12]。多位學者分別在膀胱癌[13]、肝癌[14]、肺癌[15]等腫瘤組織中證實，MFN2 在腫瘤中呈低表達，可能發揮抑癌基因作用，但在子宮內膜癌中的研究較少。

本研究結果顯示，MFN2 在子宮內膜癌組織中的表達均低于非典型增生及正常子宮內膜組織。MUSICCO 等[16]研究認為，I型子宮內膜癌組織中MFN2 蛋白表達低于正常內膜組織及內膜增生組織，在有線粒體突變的癌組織中降低更為顯著，這與本研究結果一致。進一步分析子宮內膜癌患者的臨床病理特征，結果表明MFN2 蛋白低表達與子宮內膜癌患者的病理類型、分化程度、FIGO 分期及有無淋巴結轉移有關；而與患者年齡、是否絕經及肌層浸潤深度無關，提示MFN2 蛋白低表達與子宮內膜癌的發生、發展有重要關系。MITSUDOMI 等[17]研究發現，MFN2基因在人乳腺癌MCF-7 細胞系中表達降低，而過表達MFN2 后可抑制MCF-7 細胞增殖。徐斌武等[18]研究證實，MFN2 蛋白在骨肉瘤細胞中表達降低可促進腫瘤細胞增殖、侵襲和腫瘤細胞干性特征，這些研究均提示MFN2基因在腫瘤的發生、發展過程中起抑癌基因的作用，其低表達將促進腫瘤的進展。因此認為，MFN2 蛋白在子宮內膜癌中低表達，可能發揮抑癌基因作用，低表達可能促進子宮內膜癌腫瘤細胞的增殖、侵襲。

Kaplan-Meier 法生存曲線結果顯示，本研究中MFN2 低表達子宮內膜癌患者的中位生存期為23.5 個月，高表達患者的中位生存期為32.5 個月，MFN2 低表達患者的中位生存期低于高表達患者。SOARES等[19]應用免疫組織化學方法檢測頭頸部黏膜黑色素瘤組織中MFN2 蛋白表達，發現MFN2 蛋白在腫瘤組織中低表達，且與較低的無病生存期和總生存期有關。本研究結果與SOARES 等[19]的結果一致。因此，在今后的臨床治療中可通過檢測MFN2 蛋白在子宮內膜癌組織中的表達來作為對患者預后的重要參考指標。

綜上所述，MFN2 的表達與子宮內膜癌的病理類型、FIGO 分期、分化程度及淋巴結轉移有關，提示兩者可能與子宮內膜癌的發生、發展密切相關。因此，檢測兩者的相關性可對疾病的預后有提示作用，為子宮內膜癌的診治提供新的思路和線索。