口腔鱗狀細胞癌患者唾液microRNA-342和Naa10p表達與頸淋巴結隱匿性轉移的關系

淦岷，王永武，王麗，陸偉，段青云

（1.浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院 口腔科，浙江 杭州 310006；2.杭州市丁橋醫院 口腔科，浙江 杭州 310022）

頸部淋巴結隱匿性轉移是頭頸外科惡性腫瘤研究的重點，尤其是對臨床檢查陰性（cN0）者進行頸淋巴結清掃一直存有爭議[1]。黃建瑤等[2]學者報道cN0期口腔鱗狀細胞癌（oral squamous carcinoma,OSCC）患者側頸部淋巴結隱匿性轉移率約為28.1%。目前臨床頸部隱匿性轉移淋巴結多為有創性，包括超聲引導下針吸細胞學檢查、正電子發射體層攝影術、前哨淋巴結活檢術等，由于其對臨床經驗和檢測技術要求較高，而且費用昂貴，因此難以在全國范圍內開展[3]。目前與淋巴結轉移密切相關的分子生物學有望為臨床無創檢測提供新的方法和思路。Naa10p 屬于N-乙酰轉移酶家族成員之一，其作用靶點眾多、調控網絡復雜，與腫瘤細胞的增殖、侵襲、轉移等密切相關，在多種惡性腫瘤組織中呈高表達[4]。microRNA-342（miR-342）位于14 號染色體編碼Enah/Vasp 樣蛋白的內含子上，對舌癌、肝癌等的轉移都有一定影響，關于miR-342 在OSCC 中的研究尚少。本研究旨在探討OSCC 患者唾液中miR-342 表達和Naa10p 水平與臨床病理特征和頸部淋巴結隱匿性轉移的關系，旨在為OSCC 的臨床診斷和個體化治療提供依據。現報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

選取2017年5月—2019年12月浙江大學醫學院附屬杭州市第一人民醫院接受原發灶擴大切除術及頸部淋巴結清掃術的OSCC 患者85 例作為OSCC 組。OSCC 組男性57 例，女性28 例；年齡28 ～76 歲，平均（56.01±11.78）歲；舌癌37 例，牙齦癌23 例，頰黏膜癌12 例，口底癌8 例，硬腭癌5 例；經術中或術后病理檢查確診為頸淋巴結隱匿性轉移者35 例。同期于本院就診的30 例癌前病變患者作為癌前病變組，其中男性18 例，女性12 例；年齡18 ～79 歲，平均（57.37±14.56）歲；口腔扁平苔癬患者14 例，口腔白斑患者11 例，口腔紅斑者3 例，慢性潰瘍長期不愈者2 例。隨機選擇同期于本院體檢的健康志愿者30例作為對照組，經口腔檢查確診無口腔黏膜或牙周黏膜疾病，全身檢查無系統性疾病。其中男性15 例，女性15 例；年齡22 ～80 歲，平均（59.23±16.71）歲。納入標準：①原發性鱗狀細胞癌；②首次確診；③術前未經放、化療及其他抗腫瘤治療；④術前臨床資料完整，經捫診、影像學（CT、MRI）檢查未發現頸部淋巴結轉移，確診為cN0。排除標準：合并其他惡性腫瘤、急慢性感染、嚴重肝和腎功能障礙、心腦血管疾病或其他有可能干擾miR-342 表達、Naa10p 水平表達者。本研究經醫院醫學倫理委員會批準，且與所有研究對象簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 唾液標本采集采集OSCC 組術前，癌前病變組確診時及對照組入組時和晨起唾液標本，采集前需用清水漱口5 min。收集2 份未經刺激的唾液標本各2 ml，室溫下離心，將清亮唾液保存至無菌樣本管中，于-80℃保存備用。

1.2.2 qRT-PCR采用Trizol 法抽提唾液上清液總RNA。采用試劑盒進行逆轉錄，miR-342 莖環引物序列為：5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCC GAGGTATTCGCACTGGATACGACACAGCC-3'，長度45 bp；內參小分子U6 snRNA 引物序列為：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，長度47 bp。以逆轉錄得到的cDNA 為模板，冰浴中配制20μl PCR 反應體系，包括2×SsoAdvanced SYBR Green Supermix 10μl，cDNA 模板2μl，正反向引物各1μl，加入dd H2O 水適量。反應條件：95℃預變性30 s，95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，共40 個循環，60℃繼續延伸5 min。將閾值設定在熒光值對數圖的線性部分，計算循環閾值。以2-ΔΔCt法計算相對表達量。

1.2.3 唾液Naa10p 檢測嚴格按照ELISA 試劑盒說明書進行操作，先配制標準品溶液，治療濃度分 別 為2 000.00 pg/ml、1 000.00 pg/ml、500.00 pg/ml、250.00 pg/ml、125.00 pg/ml、62.50 pg/ml、31.25 pg/ml及0.00 pg/ml，檢測酶標儀450 nm 處的光密度值，根據標準品的光密度值繪制標準曲線。另采用同樣步驟檢測樣本的光密度值，計算其對應的質量濃度。

1.3 試劑和儀器

Naa10p 酶聯試劑盒購自上海聯邁生物工程有限公司（檢測范圍31.25 ～2 000 pg/ml，檢測限：9.64 pg/ml，重復性：板內變異系數＜10%，板間變異系數＜15%）。Trizol LS 試劑盒購自美國Invitrogen 公司，mirVana PARIS Kit 購自美國Ambion 公司，One Step PrimeScript cDNA Synthesis Kit 和SYBR Green PCR master Mix 購自日本TaKaRa 公司，酶標儀、iQ5 Realtime PCR System 購自美國Bio-Rad 公司。

1.4 統計學處理

數據分析采用SPSS 19.0 統計軟件。計量資料以均數±標準差（±s）表示，比較用t檢驗或方差分析，進一步兩兩比較用LSD-t檢驗；計數資料以率（%）表示，比較用χ2檢驗。繪制ROC 曲線，影響因素的分析采用多因素Logistic 回歸模型，相關性分析用Pearson 法，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組臨床資料比較

各組唾液中miR-342 表達及Naa10p 水平比較，經單因素方差分析，差異有統計學意義（P＜0.05）；癌前病變組和OSCC 組miR-342 表達較對照組降低，Naa10p 水平較對照組升高（P＜0.05）。另外，OSCC組miR-342 表達較癌前病變組降低，Naa10p 水平較癌前病變組升高（P＜0.05）。各組年齡、性別比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

表1 各組臨床資料比較

2.2 OSCC 患者唾液miR-342 與Naa10p 蛋白的相關性

經Pearson 相關性分析，OSCC 患者唾液miR-342與Naa10p 蛋白呈負相關（r=-0.693，P=0.000）。見圖1。

2.3 OSCC 患者唾液miR-342 表達及Naa10p水平與臨床病理特征的關系

不同腫瘤生長方式、腫瘤直徑及是否發生頸淋巴結隱匿性轉移的OSCC 患者唾液miR-342 表達及Naa10p 水平比較，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

圖1 OSCC 患者唾液miR-342 與Naa10p 蛋白的相關性散點圖

表2 OSCC 患者臨床病理特征與唾液miR-342、Naa10p 相對表達量的關系 （±s）

表2 OSCC 患者臨床病理特征與唾液miR-342、Naa10p 相對表達量的關系 （±s）

臨床特征 n miR-342 t/F 值 P 值 Naa10p 蛋白/（pg/ml） t/F 值 P 值性別男57 0.73±0.26 1.037 0.303 307.49±159.64 0.654 0.515女28 0.79±0.23 283.74±152.53年齡≤50 歲 26 0.81±0.24 1.376 0.173 313.62±168.31 0.542 0.589＞50 歲 59 0.73±0.25 293.52±152.59原發灶部位舌癌 37 0.73±0.25 0.323 0.862 307.63±171.16 0.063 0.993牙齦癌 23 0.76±0.26 297.37±153.32頰黏膜癌 12 0.72±0.27 295.18±148.74口底癌 8 0.83±0.24 278.19±152.02硬腭癌 5 0.78±0.24 296.44±143.61分化程度高-中分化 54 0.76±0.25 0.525 0.601 297.70±158.11 0.152 0.880低-未分化 31 0.73±0.26 303.10±157.09生長方式外生型 45 0.78±0.24 3.923 0.024 266.83±145.80 4.784 0.011潰瘍型 28 0.78±0.27 301.86±175.06浸潤型 12 0.57±0.15 417.71±89.06腫瘤直徑T1（＜2 cm） 24 0.94±0.17 42.008 0.000 200.69±118.73 19.276 0.000 T2（2～4 cm） 43 0.77±0.20 290.84±121.53 T3/4（＞4 cm） 18 0.44±0.11 452.72±164.41頸淋巴結隱匿性轉移否50 0.83±0.24 3.778 0.000 259.85±135.27 2.921 0.005是35 0.64±0.21 356.56±169.49

2.4 OSCC 患者唾液miR-342 和Naa10p 對頸淋巴結隱匿性轉移的診斷價值

經ROC 曲線分析，唾液miR-342 和Naa10p 蛋白診斷OSCC 患者頸淋巴結隱匿性轉移的截斷值分別為0.595、386.10 pg/ml，敏感性分別為80.00%（95% CI：0.670，0.888）和78.00%（95% CI：0.648，0.872），特異性分別為54.29%（95% CI：0.382，0.695）和42.86%（95% CI：0.280，0.571），AUC 分別為0.720（95% CI：0.614，0.827）和0.662（95% CI：0.546，0.778），唾液miR-342對頸淋巴結隱匿性轉移的診斷效能高于唾液Naa10p 蛋白，差異有統計學意義（Z=7.145，P=0.000）。見圖2。

2.5 頸淋巴結隱匿性轉移的多因素Logistic 回歸分析

以頸淋巴結隱匿性轉移作為因變量，將性別、年齡、原發灶部位、腫瘤分化程度、生長方式、腫瘤直徑、miR-342 及Naa10p 納入回歸方程進行多因素Logistic 回歸分析（α入=0.05），結果顯示：腫瘤浸潤型生長方式、腫瘤直徑＞4 cm（T3/4期）和唾液Naa10p蛋白＞386.10 pg/ml 為OSCC 頸淋巴結隱匿性轉移的危險因素（P＜0.05），而唾液miR-342 ≥0.595 為OSCC頸淋巴結隱匿性轉移的保護因素（P＜0.05）。見表3。

圖2 唾液miR-342、Naa10p 蛋白診斷OSCC 患者頸淋巴結隱匿性轉移的ROC 曲線

表3 頸淋巴結隱匿性轉移的多因素Logistic 回歸分析參數

3 討論

手術是OSCC 最主要的治療方式之一，由于頭頸部的淋巴引流十分復雜，因此精確評估頸淋巴結轉移對于選擇合理的手術方式，以及療效判斷、預后評估都具有重要的臨床價值[5]。但是目前尚缺乏有效的無創檢測方法可準確判斷頸部淋巴結的隱匿性轉移灶，是導致腫瘤復發和患者預后較差的主要原因[6]。韓尚志等[7]通過回顧性分析111 例cN0OSCC 患者的臨床資料，發現頸淋巴結隱匿性轉移率為27.03%。胡馨元等[8]也證實，OSCC 頸部淋巴結的隱匿性轉移是影響患者預后的獨立危險因素。本研究共納入了85 例接受原發灶擴大切除術及頸部淋巴結清掃術的cN0原發性OSCC 患者，其中35 例（41.18%）患者發生隱匿性轉移，與其他文獻中的流行病學數據大致一致[7-8]。

近些年，隨著分子生物學技術的發展，基于RNA的生物標志物包括編碼和非編碼RNAs 逐漸被證實可用于惡性腫瘤的篩查和診斷[9]。Naa10p 屬于N-乙酰轉移酶蛋白NatA 唯一具有催化活性的亞基之一，通過催化腫瘤相關基因發生乙酰化或不依賴于乙酰化的協同轉錄抑制活性，從而參與腫瘤細胞的增殖、凋亡、侵襲、轉移等惡性生物學行為[10]。鄭軍等[11]通過Envision TM 免疫組織化學法檢測，證實OSCC 黏膜組織中Naa10p 蛋白的表達水平較白斑組織及正常黏膜組織均顯著升高，并且與原發灶TNM 分期、淋巴結轉移、組織學分化程度密切相關。目前血清、組織、糞便等都屬于常用的用于腫瘤標志物檢測的重要介質，但是筆者考慮到OSCC 位置特殊，與唾液密切接觸，唾液中含有大量唾液腺腺體細胞分泌的酶類、激素、抗體等，以及腫瘤組織中滲出的細胞因子，而且樣本采集方便、便于運輸和保存等，因此在本研究中，筆者選擇檢測唾液中miR-342 和Naa10p。結果顯示，Naa10p 在OSCC 患者唾液中的含量高于癌前病變患者和健康對照人群，這與鄭軍等[11]在OSCC 黏膜組織中的檢測結果基本一致。另外，WANG 等[12]通過細胞實驗證實，上調miR-342 表達可靶向調控急性粒細胞白血病細胞Kg1a 和HL60 中Naa10p基因的表達和轉錄，進而抑制腫瘤細胞的增殖和轉移。SONG 等[13]也發現miR-342 在OSCC 發生、發展過程具有類似抑癌基因的活性，可作為OSCC 診斷和治療的潛在靶點。在本研究中，OSCC 患者唾液中miR-342 相對表達量較癌前病變患者和健康對照人群顯著降低，而且與唾液中Naa10p 蛋白呈負相關。

除此以外，唾液中miR-342 表達、Naa10p 蛋白水平均與原發灶生長方式、腫瘤直徑和頸淋巴結隱匿性轉移均密切相關。惡性腫瘤具有呈三維方向侵襲周圍組織的形態學特征，韓尚志等[14]認為浸潤型OSCC 患者發生頸淋巴結轉移的的風險較外生型和潰瘍型更高。MELCHERS 等[15]則證實原發灶浸潤深度＞4.00 mm 可作為判斷早期口腔癌（pT1cN0）頸淋巴結轉移的臨界閾值。Naa10p 與DNA 甲基轉移酶1具有協同作用，以不依賴乙酰化活性的方式促進下游E-cadherin等抑癌基因CpG 島甲基化，進而抑制其轉錄，促進腫瘤生長和轉移。而miR-342 也可以靶向DNA 甲基轉移酶1，抑制結腸癌細胞的生長和轉移。另外，唾液中miR-342 和Naa10p 蛋白可作為頸淋巴結隱匿性轉移的重要診斷指標。唾液Naa10p 蛋白＞386.10 pg/ml 可視為評估OSCC 頸淋巴結隱匿性轉移的獨立危險因素，而唾液miR-342 ≥0.595 可視為評估OSCC 頸淋巴結隱匿性轉移的獨立保護因素。唾液miR-342 對頸淋巴結隱匿性轉移的診斷效能較Naa10p 蛋白更敏感，AUC＞0.7。考慮到本研究納入的樣本量偏少，不可避免會出現一定的假陽性結果，這也是本研究的主要缺陷。但是無論如何，唾液miR-342 和Naa10p 蛋白表達差異對OSCC 患者的淋巴結轉移確實有一定的預警價值，而且與患者腫瘤直徑和腫瘤生長方式也有關聯。

綜上所述，OSCC 患者唾液miR-342 表達降低，Naa10p 蛋白水平升高，且兩者具有靶向調控關系，唾液中miR-342 和Naa10p 表達與頸淋巴結隱匿性轉移密切相關，有望成為早期診斷的潛在指標。對于唾液Naa10p 蛋白＞386.10 pg/ml 且唾液miR-342＜0.595 的OSCC 患者，建議進行淋巴結清掃術，以免二次手術或頸部腫瘤復發。