黃 婷，王明元，秦紫藝，劉昕煒，徐志周，孫 越，劉紫萱，董 濤

（1.華僑大學園藝科學與工程研究中心，福建 廈門 361021；2.廣東省農業科學院果樹研究所/農業農村部南亞熱帶果樹生物學與遺傳資源利用重點實驗室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點實驗室，廣東 廣州 510640）

0 引言

【研究意義】油梨（Perseaamericana Mill）又名牛油果、幸福果、樟梨等，原產于拉丁美洲，我國臺灣、海南、廣東、福建、廣西、云南的大部分地區均可種植。油梨果實富含脂肪酸，被譽為“森林黃油”[1]，在醫療保健方面，具有清除有害膽固醇、軟化血管、抗老化、降血脂等多種功效[2]。在食品加工方面，油梨油具有不易被氧化，可高溫加熱而不冒煙的特點。我國自20 世紀初開始引進油梨，直到近幾年才引起廣泛關注。盡管國內油梨消費劇增，卻仍然主要依賴進口，2010—2016 年間我國油梨進口量從1.9 t 增長至2.5 萬t，進口幅度成指數增長[3]，這主要是因為我國油梨種植面積及產量品質不能滿足國內市場的需求[4]。

叢枝菌根（Arbuscular mycorrhizal, AM）真菌是一類在土壤中廣泛存在的微生物，能夠與大多數植物根系形成共生結構，促進宿主植物生長，提高植物的產量[5]、抗逆性[6]，增強植物利用水分與礦質營養的能力[7]。當前我國發現并保藏的AM 真菌共有190 多種[8]。AM 真菌的分布受土壤因子、地理因子、氣候因子、宿主植物與人為干擾因素的影響，其中的非生物因子，尤其是土壤因子的影響最為顯著[9]。【前人研究進展】已有許多研究表明了火龍果[10]、獼猴桃[11]等多種植物的根際AM 真菌多樣性與土壤因子密切相關，如火龍果根系AM 真菌孢子密度與土壤有機質、水解氮、全氮呈顯著正相關，而多樣性指數與土壤有機質呈顯著負相關；而獼猴桃根系AM 真菌孢子密度與土壤速效磷呈顯著正相關、與全氮呈極顯著負相關、與pH 呈顯著負相關。當前關于油梨的研究主要集中在栽培、選種、貯藏與營養價值及醫療保健等方面，關于油梨的生態學適應性方面的研究很少[12]。Tamayo 等[13]發現單獨或共同接種解磷菌（Mortierella sp.）與AM 真菌（Rhizoglomusfasciculatum）都可以促進油梨對磷元素的吸收以及地上部生長，且共同接種比單一接種促進效果更佳。目前尚未見有關于油梨根際AM 真菌多樣性以及其與土壤養分因子相關的文獻報道。【本研究切入點】本研究采集我國主產區油梨根際土壤，分析油梨根際AM 真菌多樣性，以及與土壤相關理化性質之間的關系。【擬解決的關鍵問題】進一步闡明油梨植物、AM 真菌和土壤養分三者之間的關系，篩選AM真菌優勢種，充分利用AM 真菌資源進行油梨果園的水肥管理、引種栽培，從而促進油梨的產業化發展。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采樣時間于2018 年春季，土壤樣品采集地點位于我國油梨主產區（表1）：廣東省（廣東省農業科學院果樹研究所）、廣西壯族自治區（廣西崇左市扶綏縣山圩鎮山圩農場）和云南省（保山市隆陽區潞江鎮芒棒村，德宏州瑞麗市勐秀鄉戶瓦村，德宏州瑞麗市勐秀鄉勐秀村，德宏州瑞麗市云南省農業科學院熱經所瑞麗實驗站）等地采集12 個土壤樣品。樣品采集：在每一個采樣地采用隨機取樣法，選取5 株油梨樹，在滴水線范圍，剝離土壤表層枯葉、雜草、碎石，利用取土器收集0～20 cm 土樣，其中每株樹沿滴水線均勻采集5 份土壤，共計1 kg，混合均勻，帶回實驗室。將所有土壤樣品均勻鋪在報紙上，去除大顆粒碎石、雜質，置于室溫下通風干燥2 周，待測。

表1 油梨根際土壤樣品來源Table 1 Source of avocado rhizosphere soil samples

1.2 AM 真菌孢子分離與鑒定

采用濕篩傾析-蔗糖離心法分離油梨根際土壤中AM 真菌孢子[14]，在體式顯微鏡下計數。用移液槍吸取單個孢子于載玻片上，采用水、PVLG、乳酸等做浮載劑，顯微鏡下觀察孢子顏色，連孢菌絲特征，并測量孢子大小。微用力壓破孢子觀察孢壁層次，厚度，顏色以及內含物，輔助鑒定使用Melzer’s 試劑，觀察是否變色及變色情況，拍照記錄。

參照Schenck 等[15]的《VA 菌根真菌鑒定手冊》，劉潤進等[16]的《菌根學》以及國際AM 真菌孢子鑒定網站INVAM（http://invam.caf.wvu.edu,edu/Myc-Info/）的分類描述及近年來發表的新種進行（屬）種的檢索及鑒定。

1.3 AM 真菌多樣性指標

孢子密度（spore density, SD）=每100 g 風干原始土樣中總AM 真菌孢子數。

種的豐度（species richness, S）=油梨根際每100 g土壤中AM 真菌種的數目。

分離頻度（frequency, F）=（AM 真菌某種或屬的樣方數/總樣方數）×100%。

相對多度（relative abundance, RA）=（AM 真菌某種或屬的孢子數/AM 真菌總孢子數）×100%。

重要值（importance, I）=采用樣點或環境中AM真菌的屬（種）的分離頻度、相對多度的平均值（重要值），即I=（F+RA）/2。優勢屬、種劃分：根據結果將AM 真菌劃分為4 個優勢度等級，I≥50%為優勢屬、種；I≥30%～50%為常見屬、種；I≥10%～30%為較常見屬、種；I＜10%為稀有屬、種。

Shannon-Weiner 物種多樣性指數（H）：假設1個包含N 個體的隨機樣本，其種i 的個體數為Ni，則Pi=Ni/N。因此H 可以表示為：

式中：k 為樣點中AM 真菌的種數；Pi為樣點AM真菌種的孢子密度占該樣點總孢子密度的百分比；

物種均勻度（J）= H/lnS；S 為樣點AM 真菌的種類數目。

1.4 油梨根際AM 真菌群落相似性系數測定

按Sorenson 系數公式計算不同樣地油梨根際AM 真菌群落組成相似性系數：Cs = 2j/（a +b）；j 為2 個樣地共同存在的油梨根際AM 真菌的種數目；a 為某樣地油梨根際的AM 真菌種數目，b 為另一樣地油梨根際的AM 真菌種數目。將AM 真菌群落物種相似度劃分為：極高（0.80～1.00）、高（0.61～0.80）、中（0.41～0.60）、低（0.21～0.40）、極低（＜0.20）。

1.5 油梨根系土壤理化性質分析

參照鮑士旦的《土壤農化分析》[17]，采用電位法測定土壤pH 值，重鉻酸鉀容量法-稀釋熱法測定有機質，NH4F-HCl 浸提-鉬銻抗比色法測定有效磷，堿性擴散法測定有效氮，參照楊俐萍等[18]方法，用原子吸收分光光度計測定有效鉀。采樣地根際土壤因子分析如表2。

1.6 數據統計

采用Excel 軟件進行數據整理，SPSS25.0 數據統計軟件對試驗數據進行單因素方差分析、多因素方差分析、相關性分析。

表2 油梨根際土壤因子分析Table 2 Analysis on factors of avocado rhizosphere soil

2 結果與分析

2.1 油梨根際土壤AM 真菌多樣性

2.1.1 根際土壤AM 真菌種質資源與分布 本試驗以廣東、廣西、云南主產區7 個樣地土壤中共分離AM 真菌3 屬33 種，其中球囊霉屬（Glomus）種類最豐富，共22 種，占總種數的65%；無梗囊霉屬（Acaulospora）7 種，占總種數的21%；盾巨孢囊霉屬（Scutellospra）4 種，占總種數的14%（表3）。3 屬在7 樣地中均有分布，球囊霉屬種數在各樣地分布頻度為50%～69%，無梗囊霉屬為15%～25%，盾巨孢囊霉屬為12%～25%，說明油梨根際AM 真菌種質資源豐富，其中，球囊霉屬分布頻度遠高于其他屬，為優勢屬。

由表3、4 可知，木薯球囊霉、瑞氏無梗囊霉、深紅盾巨孢囊霉、黑色盾巨孢囊霉在所有樣地中均有分布，且I＞50%，為各地共有優勢種（圖1）。近明球囊霉、疣突球囊霉在SY1 以外的樣地均有分布；疣狀無梗囊霉在SY2 以外樣地均有分布；純黃球囊霉、網狀球囊霉、副冠球囊霉、細凹無梗囊霉在RL 以外樣地廣泛存在；疣壁盾巨孢囊霉在GD 以外樣地均有分布。幼套球囊霉、金黃球囊霉、兩型球囊霉、布氏球囊霉在MX、GD 以外樣地均有分布，異型球囊霉在SY1、GD 以外樣地均有分布，沙荒球囊霉、異配盾巨孢囊霉在SY1、RL 以外樣地均有分布。重要值I 介于30%～50%為常見種，包括：白色球囊霉、純黃球囊霉、幼套球囊霉、近明球囊霉、沙荒球囊霉、金黃球囊霉、兩型球囊霉、網狀球囊霉、異性球囊霉、布氏球囊霉、副冠球囊霉、疣突球囊霉、疣狀無梗囊霉、細凹無梗囊霉、疣壁盾巨孢囊霉及異配盾巨孢囊霉。懸鉤子球囊霉為HW 的特有種。從油梨根際AM 真菌分離出較多的共有優勢種與常見種，說明這些AM 真菌可以適應油梨的種植環境，推測其可以與油梨建立良好的共生關系，而常見種沒有出現在所有樣地中，可能是因為這些種對某些土壤因子或氣候因子敏感。

2.1.2 油梨根際AM 真菌多樣性 不同樣區油梨AM 真菌種類與多樣性指數均存在較大差異（表5），其中MB 樣區種豐度最高，共分離出31 種孢子，占總種數的94%，孢子密度最高，共1 749 cfu·100 g-1，同時Shannon-Wiener 指數最高，達3.22；RL 樣區的孢子密度、種豐度及Shannon-Wiener 指數最低，說明RL 地區AM 真菌物種多樣性低；HW 與GD 種豐度很高，共分離出29 種與25 種孢子，但是孢子密度低，說明AM 真菌分布地區種豐度與孢子密度沒有直接相關性。

表3 油梨根際AM 真菌種質資源與分布情況Table 3 Germplasms and distribution of AM fungi in avocado rhizosphere soil

表4 油梨根際AM 真菌相對豐度、分離頻度、重要值Table 4 Relative richness, isolation frequency, and importance of AM fungi in avocado rhizosphere soil

2.1.3 油梨根際AM 真菌相似性分析 由表6 可知，不同采樣地油梨根際AM 真菌組成的相似性系數為0.29～0.92，其中MB 與HW、SY2、GD，以及HW與SY2、GD 之間相似性系數極高且較為接近，為0.85～0.92。SY1 與SY2、MB、HW，SY2 與MX、RL、GD，MB 與MX，MX 與HW、RL、GD 之間相似性系數水平高，為0.62～0.78。7 個采樣地之間相似性系數普遍高或者極高，其中MB 與其他樣地相似性普遍較高，說明MB 樣地油梨根際的AM 真菌種類具有代表性。SY1 樣地與GD、MX 相似性系數水平低，分別為0.29 與0.36，而這3 地油梨同為“哈斯”品種，且不同品種的油梨反而出現相似性水平高的現象，說明品種可能不是影響油梨根際AM 真菌的主要因素，更可能與其他因子相關。

2.2 油梨根際AM 真菌多樣性與土壤養分相關性

對油梨根際AM 真菌多樣性與土壤養分因子進行相關性分析（表7）。結果表明種豐度及多樣性指數與速效磷成極顯著負相關（P＜0.01），說明油梨AM 真菌多樣性受土壤速效磷含量的影響大，而與其他因素無顯著影響。

3 討論與結論

3.1 油梨根際AM 真菌多樣性

本研究發現油梨根際AM 真菌豐富，7 個樣地中共分離出AM 真菌3 屬33 種，其中球囊霉菌是優勢屬，其次是無梗囊霉屬。這與張美慶等[19]發現球囊霉屬為廣譜生態型，其次為無梗囊霉屬的結論相一致。球囊霉屬真菌與植物根系共生形成泡囊儲存脂類物質，擴大了菌絲的侵染途徑，從而能夠廣泛適應于各種生境[20]。向丹等[9]認為AM 真菌分布受土壤因子、地理因子、氣候因子及宿主植物及人為干擾的影響，其中土壤因子是最主要的影響因素。樣地間AM 真菌多樣性存在差異，但差異不大。郭紹霞等[21]發現，不同品種牡丹影響AM 真菌多樣性及群落組成。而在本研究中，種植不同油梨品種“哈斯”、“福瑞特”、“緬甸品種1”、“緬甸品種2”的土壤AM 真菌之間相似性大多高或極高，這是因為油梨雖然是高度雜交作物，但其遺傳變異率并不高[12]。因此不同品種油梨對AM 真菌的影響并不大。而種植同一“哈斯”品種的樣區反而存在土壤AM 真菌相似性低的現象，這可能是因為油梨種植區允許其他矮小的草本植物覆蓋土表，宿主多樣性會影響AM 真菌的多樣性。但更可能的因素是各地土壤養分差異大，造成真菌多樣性的差異。決定AM 真菌多樣性的并不是單一的因素，而是各生態因子作為整體綜合發揮作用的結果[21]。MB 與其他樣地相似性普遍高，說明MB 樣地最能代表7 個樣地油梨根際的AM真菌種類。

表5 不同試驗區AM 真菌孢子密度、種豐度、多樣性指數Table 5 Spore density, species richness, and diversity index of AM fungi at different sites

表7 油梨根際AM 真菌多樣性與土壤因子相關性分析Table 7 Correlation between AM fungal diversity and rhizosphere fertility

接種AM 真菌Rhizoglomusfasciculatum 可有效提高油梨對P 的吸收以及地上部的生長[13]。說明AM真菌可與油梨形成共生結構，促進油梨生長發育。陳保東等[22]認為接種土著AM 真菌，由于長期適應環境，更容易與植株根系形成共生結構，而接種其他AM 真菌，可能要面臨與當地真菌強烈競爭，導致接種失敗。因此油梨專用菌肥可從油梨根際土壤分離的AM 真菌中篩選，更容易得到好的效果。此外，研究已發現蜜色無梗囊霉、聚叢球囊霉、幼套球囊霉及摩西球囊霉可以顯著促進多種植物，如藍莓、構樹等吸收P 元素，促進植株生長，并提高根際酶活性，改善根際微環境[23、24]。推測這些AM 真菌對于廣泛適應于多種植物根系，推測接種油梨根系時，對油梨生長也會有很好的促生效果。為篩選專用菌肥提供參照。

3.2 AM 真菌與土壤因子關系

本研究表明，AM 真菌種豐度及多樣性指數與土壤P 含量呈顯著負相關，這與劉海躍等的研究結果一致。土壤高濃度的有效磷抑制叢枝菌根的生長發育，縮短菌絲分枝和總長度，這是由于磷濃度高時寄主植物根系分泌物成分發生變化導致的[25]。土壤內的磷總量十分豐富，但大多被礦石等固定，不能為植物吸收。AM 真菌能夠分解土壤中難溶磷，轉化為宿主植物可吸收的養分，分泌并活化多種土壤酶類，降低pH，提高土壤養分含量，并通過菌根結構轉移給植物根系，同時擴大宿主植物根系網絡，讓根系吸收更多的營養，同時疏松土壤，增加根系透氣性。AM 真菌與植物共生機制是“雙贏”的營養交換模式，AM 真菌為植物提供礦質營養與養分，而植物為AM 真菌提供C 源保證真菌生長與繁殖。當土壤N、P 缺乏時，植物受營養脅迫上調獨腳金內酯的表達，刺激AM 真菌繁殖并侵染根系，以換取自身得到更多的土壤養分[26]。因此，適當的磷脅迫，可以刺激更多AM 真菌與植株根系建立共生結構。Elisa Bona 等研究發現，對油梨同時施用AM 真菌與解磷菌對油梨的生長量與吸收磷的效果比單獨施用AM 真菌或解磷菌的效果好[27]。在磷含量高的土壤區域接種AM 真菌，即使土壤內天然AM 真菌含量高，也能夠顯著提高AM 真菌豐度并顯著提高作物生長量，并在一定程度上可以代替磷肥[28]。

劉潤進等[29]認為在一定范圍內，有機質含量越高，AM 真菌孢子密度與多樣性越高；而超過一定范圍，反而受抑制。本研究中，MB 樣地有機質含量最高，其孢子密度、種豐度與多樣性指數也最高，其中孢子密度達1 749 cfu·g-1。而有機質含量最低的RL樣地，各指數也最低，孢子密度僅109 cfu·g-1，但其余樣地沒有表現出這樣的相關性，可能是受其他養分因素的綜合影響大。如MX 樣地，有機質與速效磷含量適中，但土壤AM 真菌孢子密度不高，可能的原因是，MX 樣地堿解氮含量高，硝態氮積累多，導致土壤pH 偏低（4.04），抑制AM 生存，同時樣地海拔較高，氣候較冷，不適于AM 真菌生長發育。

研究表明，使用化肥N、P 元素，與土壤內AM真菌直接接觸會降低AM 真菌多樣性與活性，在油梨種植園區，應減少使用無機肥料，以有機肥或緩釋肥代替無機肥，不造成土壤養分大起大落，為AM真菌定植與侵染油梨根系，提供相對穩定的環境。從長遠上看，建立AM 真菌穩定的土壤生態環境，對于減少化肥與農藥使用量有重要意義，可以降低生產成本，減輕農戶負擔，使農戶更樂于使用。