基于非酒精性脂肪肝體外細(xì)胞模型對(duì)藏藥 “松蒂” 基原植物中6 個(gè)多酚類(lèi)化合物的活性評(píng)價(jià)

阿都莫子力 魏榮銳 秦偉瀚 馮海青 任 剛 朱繼孝 萬(wàn)鑫浩 金重先蔣 偉? 鐘國(guó)躍?

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心， 江西 南昌330004； 2.重慶市中藥研究院， 重慶400065； 3.荊州市食品藥品檢驗(yàn)所， 湖北 荊州434000）

“松蒂” 是藏醫(yī)臨床用于治療肝膽疾病的一類(lèi)常用藥材，其基原植物主要為多種藏區(qū)虎耳草屬植物［1］，具有清肝膽之熱、排膿斂瘡之效，多用于肝炎、膽囊炎等［2］。高原民族喜吃牛羊肉、糌粑、酥油茶、甜茶等高熱量食物，較少食用蔬菜瓜果等膳食纖維，這種高脂、高糖、高蛋白、低膳食纖維的飲食結(jié)構(gòu)以及經(jīng)濟(jì)生活水平提高帶來(lái)的體力活動(dòng)減少使藏族人群中脂肪肝患者比例較高［3?4］，并呈逐年上升趨勢(shì)。在藏醫(yī)臨床上，“松蒂” 類(lèi)藥材常作為組方藥物用于治療脂肪肝，如治療肝膽類(lèi)疾病的首選藏藥二十五味松石丸［5?6］。

非酒精性脂肪肝（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指無(wú)過(guò)量飲酒史，肝細(xì)胞發(fā)生脂肪病變，形成脂質(zhì)堆積的一種臨床病理綜合征，發(fā)病趨勢(shì)主要從單純性脂肪病變、脂肪性肝炎、肝纖維化最終衍變?yōu)楦渭?xì)胞癌［7］。目前，對(duì)NAFLD的研究通常采用的是動(dòng)物模型，但存在個(gè)體差異大、研究周期長(zhǎng)、實(shí)驗(yàn)條件不易控制等問(wèn)題，而細(xì)胞模型很好地克服上述問(wèn)題，同時(shí)能夠有效縮短實(shí)驗(yàn)進(jìn)程，適用于批量藥物的篩選［8］。前期對(duì)“松蒂” 基原植物的藥理研究表明，其提取物對(duì)動(dòng)物或細(xì)胞化學(xué)性肝損傷具有一定的抵抗作用［9?10］，另外相關(guān)化學(xué)文獻(xiàn)顯示其含有大量的黃酮類(lèi)、酚酸類(lèi)、二苯庚烷類(lèi)等多酚類(lèi)成分，而且抗各種類(lèi)型肝損傷的研究報(bào)道較多。本實(shí)驗(yàn)復(fù)制了NAFLD 體外LO2 細(xì)胞模型模擬體內(nèi)脂質(zhì)堆積，然后給予單體成分對(duì)模型細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，研究從“松蒂” 基原植物中發(fā)現(xiàn)的6 個(gè)多酚類(lèi)成分對(duì)細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)形成的影響，從而探討該類(lèi)藥材在治療NAFLD 方面的藥效成分基礎(chǔ)及可能作用機(jī)制。

1 材料

1.1 細(xì)胞株 LO2 細(xì)胞株購(gòu)自武漢普諾賽（Procell）生命科技有限公司，保存于江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心實(shí)驗(yàn)室。

1.2 試劑與藥物 對(duì)照品蘆丁（批號(hào)10000?201408）、金絲桃苷（批號(hào)11521?201205）、沒(méi)食子酸（批號(hào) 110831?200803）、山柰酚（批 號(hào)110861?201310）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；異槲皮苷（批號(hào)1330?101226）購(gòu)自江西中藥固體制劑制造技術(shù)國(guó)家工程研究中心。白樺林烯酮由本實(shí)驗(yàn)室自“松蒂” 基原植物篦齒虎耳草中分離得到。胎牛血清（上海雙洳生物科技有限公司，批號(hào)OH12343）；油酸OA（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)SLBZ5247）；油 紅O（美 國(guó)Sigma 公 司，批 號(hào)002420145）；二甲亞砜DMSO（北京Solarbio 公司，批號(hào)1012D032）；甘油三酯試劑盒TG（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20191205）；BCA 蛋白試劑盒（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)98F00140）；超氧化物歧化酶SOD 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20190717）；細(xì)胞丙二醛MDA 試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號(hào)20190513）；PBS 緩沖液（北京Solarbio 公司，批號(hào)P1020?500）；Trypsln?EDTA（北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司，批號(hào)910080101100）；蓋玻片、載玻片（江蘇世泰實(shí)驗(yàn)器材有限公司，批號(hào)80312?2101）。

1.3 儀器 顯微鏡（日本Nikon 公司，型號(hào)DMI300）；全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo 公司，型號(hào)Multiskan Go1510）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司，型號(hào)5430）；手持式勻漿機(jī)（美國(guó)Biodex 公司，型號(hào)Tissue?Tearor）。

2 方法

2.1 體外非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型的復(fù)制 LO2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、1%雙抗（青霉素和鏈霉素）的RPMI?1640 培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，以5×104／孔密度接種于6 孔培養(yǎng)板中，取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置空白組與模型組。根據(jù)前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果建立脂肪肝細(xì)胞模型所用油酸的最佳作用濃度和時(shí)間分別為200 μmol／L、24 h，并檢測(cè)模型TG 水平，結(jié)合油紅O 染色法觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴變化，評(píng)價(jià)體外非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型是否復(fù)制成功。

2.2 磺酰羅丹明B 比色法（sulfonyl rhodamine B colorimetry，SRB）檢測(cè)化合物對(duì)LO2 細(xì)胞增殖的影響 將LO2 細(xì)胞按5×104／孔濃度接種于6 孔板中，于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h 后，各化合物設(shè)置3 個(gè)給藥濃度（100、50、25 μmol／L），進(jìn)行3 次平行實(shí)驗(yàn)。給藥48 h 后，采用SRB 法檢測(cè)細(xì)胞增殖，選擇對(duì)細(xì)胞活性無(wú)明顯影響的濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 細(xì)胞內(nèi)TG、SOD、MDA 水平的測(cè)定 將LO2細(xì)胞按5×104／孔濃度接種于6 孔板中，于37 ℃、5% CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h，分為空白組、模型組及山柰酚（50、25 μmol／L）、異槲皮 苷（100、50 μmol／L）、沒(méi)食子酸（100、50 μmol／L）、金絲桃苷（100、50 μmol／L）、蘆丁（100、50 μmol／L）、白樺林烯酮（100、50 μmol／L）組，除空白組外，各給藥組給藥24 h 后進(jìn)行油酸造模，24 h 后收集細(xì)胞懸液于1.5 mL 離心管中，預(yù)冷PBS 清洗1～2 次，于4 ℃、1 000 r／min下離心10 min，棄上清液留細(xì)胞沉淀，加入裂解液200 μL／管，冰上裂解20 min后按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行TG 水平檢測(cè)。在檢測(cè)SOD、MDA 時(shí)，于細(xì)胞沉淀中加入預(yù)冷的300 mL PBS 緩沖液進(jìn)行手動(dòng)勻漿破碎細(xì)胞，再按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定，重復(fù)3 次。

2.4 油紅O 染色觀察細(xì)胞內(nèi)脂滴的形成 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的LO2 細(xì)胞接種于6 孔板中，于37 ℃、5%CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h，按“2.3” 項(xiàng)下方法分組，除空白組外各組給藥24 h 后進(jìn)行油酸造模，24 h 后進(jìn)行油紅O 染色，甘油明膠封片，顯微鏡下觀察，拍照，重復(fù)3 次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用graphpad prism 6.01 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 體外非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型復(fù)制 在前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)，造模劑油酸濃度為200 μmol／L時(shí)造模24 h 后，對(duì)LO2 細(xì)胞存活無(wú)影響，并且細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生脂滴及甘油三酯相對(duì)較多，故以其為非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型復(fù)制的條件。與空白組相比，模型組細(xì)胞內(nèi)TG 水平增加（P＜0.01，圖1A），同時(shí)模型組細(xì)胞內(nèi)呈現(xiàn)脂滴（圖1B）。

圖1 油酸對(duì)LO2 細(xì)胞中TG 水平及脂滴形成的影響Fig.1 Effects of oleic acid on TG level and lipid droplet formation in LO2 cells

3.2 各化合物實(shí)驗(yàn)給藥濃度的選擇 通過(guò)SRB 法檢測(cè)不同濃度化合物對(duì)LO2 細(xì)胞的存活率，選擇對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響者作為實(shí)驗(yàn)濃度，每個(gè)化合物分別設(shè)置3 個(gè)濃度（25、50、100 μmol／L），結(jié)果見(jiàn)圖2。其中，異槲皮苷、沒(méi)食子酸，金絲桃苷、蘆丁和白樺林烯酮濃度在50、100 μmol／L 時(shí)對(duì)細(xì)胞存活率無(wú)明顯影響，而100 μmol／L 山柰酚對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用（P＜0.01），故選擇25、50 μmol／L 進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

3.3 各化合物對(duì)LO2 細(xì)胞中TG 水平的影響 與空白組相比，模型組TG 水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，山柰酚濃度在25、50 μmol／L 時(shí)均可降低TG 水平（P＜0.01），而異槲皮苷、沒(méi)食子酸、蘆丁、白樺林烯酮濃度在100 μmol／L 時(shí)可降低TG 水平（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)圖3。

3.4 各化合物對(duì)LO2 細(xì)胞中脂滴形成的影響 與空白組相比，模型組細(xì)胞中形成的紅色脂滴數(shù)量增多，細(xì)胞外形成“連珠” 狀紅色脂滴環(huán)；與模型組相比，各給藥組細(xì)胞外紅色脂滴的數(shù)量以及脂滴堆積程度均有所下降，其中山柰酚、沒(méi)食子酸及100 μmol／L異槲皮苷、蘆丁、白樺林烯酮能減少紅色脂滴形成，細(xì)胞外“連珠” 狀脂滴尚未成環(huán)，而金絲桃苷組較其他組降低脂滴形成的趨勢(shì)較弱。見(jiàn)圖4。

圖2 不同濃度單體成分對(duì)LO2 細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different concentrations of monomer components on the survival rate of LO2 cells

圖3 單體成分對(duì)LO2 細(xì)胞中TG 水平的影響Fig.3 Effects of monomer components on TG level in LO2 cells

3.5 各化合物對(duì)LO2 細(xì)胞中SOD 水平的影響 與空白組相比，模型組SOD 水平降低（P＜0.01）；與模型組相比，50 μmol／L 山柰酚及100 μmol／L 沒(méi)食子酸、金絲桃苷、蘆丁、白樺林烯酮可升高SOD 水平（P＜0.05，P＜0.01），而各濃度異槲皮苷均可升高SOD 水平（P＜0.05）。見(jiàn)圖5。

3.6 各化合物對(duì)LO2 細(xì)胞中MDA 水平的影響 與空白組相比，模型組MDA 水平升高（P＜0.01）；與模型組相比，異槲皮苷、金絲桃苷、蘆丁濃度在50、100 μmol／L 時(shí)能降低MDA 水平（P＜0.05，P＜0.01），而50 μmol／L 山柰酚 及100 μmol／L沒(méi)食子酸、白樺林烯酮可降低MDA 水平（P＜0.01）。見(jiàn)圖6。

4 討論

非酒精性脂肪肝是世界范圍內(nèi)最常見(jiàn)的慢性肝病，主要特征表現(xiàn)為脂質(zhì)的積累和胰島素抵抗［11］。其發(fā)病機(jī)制多樣，“二次打擊” 學(xué)說(shuō)是目前最為廣泛接受的學(xué)說(shuō)，1988 年由Day 等首次提出［12］。“首次打擊” 由胰島素抵抗（insulin resistance，IR）引起，此時(shí)外周脂肪分解及合成脂肪增加，進(jìn)入肝臟的游離脂肪酸增加，游離脂肪酸氧化加強(qiáng)，促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)活性氧、腸源性內(nèi)毒素、促炎性細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生，引起激素敏感性脂肪酶的抑制作用下降，多余的游離脂肪酸蓄積在肝臟中，形成TG 在肝臟上的堆積［13］，而油酸是一種不飽和脂肪酸，是細(xì)胞內(nèi)游離脂肪酸的來(lái)源，可引起脂毒性，導(dǎo)致線粒體功能破壞抑制脂代謝相關(guān)酶的活性，引發(fā)氧化應(yīng)激形成二次打擊［14］。NAFLD 的氧化應(yīng)激源于細(xì)胞內(nèi)過(guò)量游離脂肪酸的氧化過(guò)程，這將導(dǎo)致活性氧ROS 的過(guò)度產(chǎn)生［15］。SOD 是生物體內(nèi)最為重要的抗氧化酶之一，是清除ROS 的第一道防線［16］，其活性降低將導(dǎo)致自由基在體內(nèi)蓄積引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧，而MDA 是一種穩(wěn)定的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物，常常作為判斷脂質(zhì)過(guò)氧化的指標(biāo)［17］。

圖4 單體成分對(duì)LO2 細(xì)胞中脂滴形成的影響（×400）Fig.4 Effects of monomer components on the formation of lipid droplets in LO2 cells（×400）

圖5 單體成分對(duì)LO2 細(xì)胞中SOD 水平的影響Fig.5 Effects of monomer components on SOD level in LO2 cells

圖6 各單體成分對(duì)LO2 細(xì)胞中MDA 水平的影響Fig.6 Effects of monomer components on MDA level in LO2 cells

在抗NAFLD 體外藥效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)的文獻(xiàn)報(bào)道中［11?16］，均未見(jiàn)設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組，原因可能是目前還沒(méi)有針對(duì)本實(shí)驗(yàn)中所采用NAFLD 體外模型的合適陽(yáng)性藥物。本研究也未設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照組，而藥物組相較于模型組的各項(xiàng)指標(biāo)變化，也足以說(shuō)明藥物效果。

基于以上NAFLD 的發(fā)病機(jī)制及已有相關(guān)體外模型的國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道，本研究不斷優(yōu)化造模實(shí)驗(yàn)條件，最終選擇200 μmol／L 油酸作用于LO2 細(xì)胞24 h，成功復(fù)制非酒精性脂肪肝細(xì)胞模型，顯微鏡下觀察模型組相較于空白對(duì)照組，紅色脂滴數(shù)量明顯增多，細(xì)胞外形成“連珠” 狀紅色脂滴環(huán)，細(xì)胞內(nèi)TG、氧化應(yīng)激水平顯著增加（MDA 水平顯著升高，SOD 水平顯著降低），與文獻(xiàn)中模型建立成功的評(píng)價(jià)指標(biāo)基本一致［8，14，18?19］，說(shuō)明本研究體外細(xì)胞模型復(fù)制成功，可用于抗NAFLD 藥物的體外藥效評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)。

本研究中的多酚類(lèi)化合物在藏區(qū)虎耳草屬多種植物（“松蒂” 基原植物）的化學(xué)成分相關(guān)文獻(xiàn)中均有報(bào)道［20?25］，在“松蒂” 基原植物的化學(xué)成分組成中具有一定的代表性，而且在抗各種肝損傷活性方面有較多研究報(bào)道［26?29］。本研究利用NAFLD體外細(xì)胞模型對(duì)上述化合物進(jìn)行藥效評(píng)價(jià)研究，表明它們均可不同程度減少細(xì)胞內(nèi)TG 水平，抑制MDA 水平，同時(shí)提高SOD 活性，并減少細(xì)胞內(nèi)脂滴形成，從而一定程度上說(shuō)明“松蒂” 類(lèi)藥材中所含具有一定代表性的多酚類(lèi)成分可能是其抗NAFLD 的藥效物質(zhì)組成成分，其抑制體外脂肪肝細(xì)胞模型中脂質(zhì)形成的機(jī)制可能與多酚類(lèi)成分的抗氧化應(yīng)激作用相關(guān)，值得繼續(xù)深入研究。