芍藥苷對(duì)氯化鈷誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的保護(hù)作用

雷 昌 黃 丹 向 韻張秀麗孟 盼鄒蔓姝王宇紅凌成利?

（1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)， 湖南省中藥粉體與創(chuàng)新藥物省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地， 湖南 長(zhǎng)沙410208；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)科技創(chuàng)新中心， 湖南 長(zhǎng)沙410208）

芍藥苷來(lái)源于毛莨科種屬，是從白芍和赤芍干燥根提取的主要活性成分，為一種單萜糖苷類化合物，具有抗氧化應(yīng)激損傷、抗血栓、抗炎、抗高血壓、鎮(zhèn)痛、抗血小板聚集等作用［1?2］。有文獻(xiàn)表明芍藥苷對(duì)大鼠缺血性腦卒中引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有顯著療效，可通過(guò)Ca2＋／CaMKⅡ／CREB 信號(hào)通路降低炎癥因子表達(dá)［3］，同時(shí)也有文獻(xiàn)闡述了芍藥苷能降低血液黏度、抗血小板聚集、擴(kuò)張血管、改善微循環(huán)、抗氧化、抗驚厥等多種作用效果［4?5］，故芍藥苷在動(dòng)物體內(nèi)對(duì)不同病理?xiàng)l件誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞損傷有保護(hù)作用。溫新麗等［6］揭示了芍藥苷對(duì)過(guò)氧化氫誘導(dǎo)的SH?SY5Y 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷有顯著保護(hù)效果，但具體機(jī)制不明。因此，本研究在PC12 細(xì)胞存活率基礎(chǔ)上，從活性氧自由基（ROS）、細(xì)胞凋亡、MMP 不同機(jī)制考察芍藥苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)高PC12 細(xì)胞氧化損傷的保護(hù)作用，為后續(xù)進(jìn)一步研發(fā)作鋪墊。

1 材料

1.1 藥物與試劑 芍藥苷（純度≥98%，批號(hào)17041401）購(gòu)自成都普飛德生物科技有限公司。氯化鈷（Cobalt chloride，CoCl2· 6H2O，批 號(hào)20180724）、ROS 試劑盒（DCFH?DA，編 號(hào)S0033）、細(xì)胞凋亡試劑盒（批號(hào)100918190307）、線粒體膜電位試劑盒（批號(hào)101118190416）均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；二甲基亞砜（DMSO，批號(hào)20130417）購(gòu)自湖南匯虹試劑有限公司；MTT ［3?（4，5?二甲基噻唑?2）?2，5?二苯基四氮唑溴鹽，批號(hào)1015D0510］購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；改良高糖細(xì)胞培養(yǎng)基（DMEM）和胎牛血清（FBS）均購(gòu)自四季青生物工程材料有限公司（杭州）；其他試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器 CO2培養(yǎng)箱（型號(hào)3131）、多功能酶標(biāo)儀（型號(hào)3001?1758）均購(gòu)自美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司（上海）；高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（型號(hào)operetta）購(gòu)自美國(guó)珀金埃爾默股份有限公司。

2 方法

2.1 PC12 細(xì)胞培養(yǎng) PC12 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，采用含10% 胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。以1 ∶2 或1 ∶3 比例進(jìn)行細(xì)胞傳代，向培養(yǎng)皿中加入0.25% Trypsin?EDTA 1.5 mL，消化約1 min 后在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)PC12 細(xì)胞回縮、類圓形，開始脫落，立即加入2 mL 培養(yǎng)基終止消化，選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在藥物處理階段，各組（包括正常組）細(xì)胞均用不含F(xiàn)BS 的DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。

2.2 MTT 檢測(cè)

2.2.1 不同濃度CoCl2、芍藥苷對(duì)PC12 細(xì)胞存活率的影響 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的PC12 細(xì)胞以3×103／孔的濃度接種于96 孔板上，每孔0.1 mL，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，待貼壁后分別采用CoCl2（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0 mmol／L）和芍藥苷（10、100、200、300、400、500、600、700、800 μg／mL）孵育24 h，每孔加入0.5 mg／mL MTT 20 μL，37 ℃避光孵育4 h 后吸棄上清液，加200 μL DMSO，避光振搖10 min 使其充分溶解，在570 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定光密度（OD），細(xì)胞存活率＝ ［（OD藥物組-OD空白組）／（OD正常組-OD空白組）］×100%，平行6 個(gè)復(fù)孔。

2.2.2 芍藥苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞存活率的影響 細(xì)胞分為正常組（正常PC12 細(xì)胞）、模型組（1.2 mmol／L CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞24 h）、芍藥苷組（不同濃度芍藥苷預(yù)先處理1 h，再加入1.2 mmol／L CoCl2共孵育24 h），按“2.2.1” 項(xiàng)下方法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率。

2.3 ROS 檢測(cè) 根據(jù)ROS 試劑盒測(cè)定細(xì)胞內(nèi)ROS水平，熒光探針DCFH?DA 按1 ∶1 000 比例用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至終濃度為10 μmol／L。按“2.2.2”項(xiàng)下方法分組接種于96 孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h 后，將培養(yǎng)液換成已稀釋好的DCFH?DA 探針溶液0.1 mL，37 ℃避光孵育30 min。PBS 洗滌2 次去除未進(jìn)細(xì)胞內(nèi)的熒光探針，采用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm），各組隨機(jī)選取6 個(gè)視野，平行3 個(gè)復(fù)孔。

2.4 細(xì)胞凋亡測(cè)定 利用Annexin V?FITC／PI 雙染色法凋亡試劑盒檢測(cè)PC12 細(xì)胞凋亡，按“2.2.2”項(xiàng)下方法分組接種于96 孔板內(nèi)，以凋亡試劑盒操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)在488、525 nm 波長(zhǎng)下檢測(cè)平均熒光強(qiáng)度。各組隨機(jī)選取6 個(gè)視野，計(jì)數(shù)細(xì)胞總數(shù)和凋亡細(xì)胞數(shù)，平行3 個(gè)復(fù)孔，計(jì)算凋亡率［（同一視野下凋亡細(xì)胞數(shù)／同一視野下總細(xì)胞數(shù)）×100%］。

2.5 MMP 測(cè)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期PC12 細(xì)胞，按“2.2.2” 項(xiàng)下方法分組，按MMP 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。高內(nèi)涵成像系統(tǒng)檢測(cè)細(xì)胞平均熒光強(qiáng)度（激發(fā)波長(zhǎng)490 nm，發(fā)射波長(zhǎng)530 nm），各組隨機(jī)選取6 個(gè)視野，平行3 個(gè)復(fù)孔。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)Graphpad Prsim 軟件進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，2 組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 不同濃度CoCl2對(duì)PC12 細(xì)胞存活率的影響0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0、3.0 mmol／L CoCl2對(duì)應(yīng)細(xì)胞存活率分別為（92.9±5.7）%、（87.9±2.3）%、（82.1±4.5）%、（73.5±2.3）%、（66.3±4.8）%、（52.1±4.5）%、（47.3±5.0）%、（43.0±3.9）%、（40.1±4.6）%、（24.2±5.6）%。圖1A 表明，與正常組（100%±3.2）%相比，CoCl2（0.6～3.0 mmol／L）可降低PC12 細(xì)胞存活率，減少細(xì)胞活性，其濃度為1.2 mmol／L 時(shí)，細(xì)胞存活率接近50%（P＜0.05），即為半數(shù)抑制濃度（IC50）。因此，采用1.2 mmol／L CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞24 h，作為PC12 細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的最佳條件。

圖1 芍藥苷對(duì)CoCl2 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞存活率的影響Fig.1 Effect of paeoniflorin on the survival rate of CoCl2?induced PC12 cells

3.2 不同濃度芍藥苷對(duì)PC12 細(xì)胞存活率的影響由圖1B 可 知，10、100、200、300、400、500、600、700、800 μg／mL 芍藥苷處理PC12 細(xì)胞24 h，細(xì)胞存活率分別為（100.3±2.3）%、（99.7±3.6）%、（99.1±3.4）%、（97.9±2.8）%、（89.3±2.4）%、（83.5±3.5）%、（74.2±2.3）%、（59.6±2.6）%、（52.0±3.0）%，其濃度在600 μg／mL 以上時(shí)對(duì)PC12 細(xì)胞有強(qiáng)烈毒副作用，在400、500 μg／mL時(shí)可降低細(xì)胞存活率（P＜0.05），有輕微毒性，故芍藥苷毒性濃度應(yīng)在400 μg／mL 以下。

3.3 不同濃度芍藥苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞存活率的影響 如圖1C 所示，與模型組比較，100、200、300 μg／mL 芍藥苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞存活率分別為（54.9±3.1）%、（63.0±2.7）%、（59.1±2.3）%，其濃度在10～500 μg／mL 范圍內(nèi)未呈濃度依賴性，而在200 μg／mL 時(shí)可增加CoCl2誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞存活率（P＜0.05）。由此表明，200 μg／mL芍藥苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞所引起的氧化應(yīng)激損傷有顯著保護(hù)作用。

3.4 芍藥苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 的影響 如圖2 所示，與正常組（11.0±2.0）比較，模型組PC12 細(xì)胞內(nèi)平均熒光值增加（52.0±2.1，P＜0.05），表明細(xì)胞內(nèi)ROS 增加；與模型組比較，200 μg／mL 芍藥苷組PC12 細(xì)胞內(nèi)平均熒光值降低（25.4±2.5，P＜0.05），表明芍藥苷可明顯抑制CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞內(nèi)ROS 的生成。

圖2 芍藥苷對(duì)CoCl2 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞生成ROS 的影響Fig.2 Effect of paeoniflorin on the ROS production of CoCl2?induced PC12 cells

3.5 芍藥苷對(duì)CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響 如圖3 所示，正常組PC12 細(xì)胞早期和晚期凋亡分布有低強(qiáng)度綠色和紅色熒光（綠色熒光代表凋亡早期，紅色代表凋亡晚期和死亡細(xì)胞）；經(jīng)CoCl2誘導(dǎo)后，模型組出現(xiàn)高強(qiáng)度綠色和紅色熒光，且胞核變小，濃縮，呈細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征；加入芍藥苷預(yù)處理后，綠色、紅色熒光強(qiáng)度降低，細(xì)胞核逐漸恢復(fù)正常形態(tài)。與正常組［活細(xì)胞比例（93.2±2.6）%，凋亡細(xì)胞比例（6.8±1.7）%］比較，模型組活細(xì)胞比例［（20.3±3.0）%］降低，細(xì)胞凋亡比例［（79.7±2.8）%］增加（P＜0.05），其中200 μg／mL 芍藥苷組活細(xì)胞比例為（57.4±2.4）%，細(xì)胞凋亡比例為（42.6±3.3）%，與模型組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3.6 芍藥苷對(duì)CoCl2所誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞MMP 的影響 如圖4 所示，與正常組比較（平均熒光值為237.6±10.3），模型組PC12 細(xì)胞綠色平均熒光值為39.8±11.2，熒光強(qiáng)度降低（P＜0.05），即線粒體膜電位下降。200 μg／mL 芍藥苷組PC12 細(xì)胞綠色平均熒光值為221.7±9.5，熒光強(qiáng)度升高（P＜0.01），說(shuō)明芍藥苷能提升MMP，保護(hù)PC12 細(xì)胞免受CoCl2誘導(dǎo)所致的損傷。

4 討論

腦缺血病理機(jī)制主要包括能量代謝障礙與梗死灶周圍缺氧去極化、興奮性氨基酸（EAA）毒性、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等［7］，其中氧化應(yīng)激損傷是其主要機(jī)制之一。氧化應(yīng)激損傷（oxidative stress）是指有機(jī)體在遭受各種有害刺激或誘導(dǎo)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的ROS 超過(guò)自身清除的ROS，導(dǎo)致ROS 細(xì)胞內(nèi)蓄積及細(xì)胞凋亡與MMP 變化，細(xì)胞引發(fā)毒性損傷的過(guò)程［8］。目前大量研究認(rèn)為，ROS、細(xì)胞凋亡及MMP 變化是氧化應(yīng)激損傷的主要指標(biāo)。

CoCl2是一種化學(xué)性氧化應(yīng)激誘導(dǎo)模擬劑，可引起神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷和凋亡，其機(jī)制是鈷通過(guò)細(xì)胞內(nèi)離子置換使亞鐵螯合酶失活，從而抑制細(xì)胞對(duì)氧的利用，最終達(dá)到常氧下誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧導(dǎo)致氧化應(yīng)激的效果［9］，由于使用方便、理化性質(zhì)穩(wěn)定而成為誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷的首選藥物，但在體外細(xì)胞上研究較少。課題組首次采用CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞模型模擬神經(jīng)細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷而出現(xiàn)的腦缺血病理狀態(tài)，具有效果理想、可重復(fù)性好及操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)。

圖3 芍藥苷對(duì)CoCl2 誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞凋亡的影響Fig.3 Effect of paeoniflorin on the apoptosis of CoCl2?induced PC12 cells

近年來(lái)，芍藥苷在細(xì)胞損傷方面的作用受到越來(lái)越多的關(guān)注。芍藥苷在白芍單萜類成分中含有量最高，也是最有效成分［10］，具有抗神經(jīng)細(xì)胞氧化、抗自由基損傷、抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載，抗細(xì)胞凋亡、促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)等作用［11］。有文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)，芍藥苷通過(guò)NO（硝普鈉）誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞可直接發(fā)揮抗細(xì)胞凋亡作用［12］。理論上，芍藥苷具有抗細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷作用，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在CoCl2誘導(dǎo)PC12 細(xì)胞損傷模型中，100、200 μg／mL 芍藥苷可清除細(xì)胞內(nèi)ROS 產(chǎn)生、減少細(xì)胞凋亡和提高M(jìn)MP，但 200 μg／mL 的細(xì)胞 保護(hù)作 用大于100 μg／mL，其原因可能是促線粒體凋亡蛋白的表達(dá)程度不同。Wang 等［13］研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞損傷與凋亡蛋白的表達(dá)有關(guān)，凋亡相關(guān)基因表達(dá)促進(jìn)p38 MAPK 磷酸化程度，加劇細(xì)胞凋亡損傷。除了線粒體凋亡通路之外，核因子轉(zhuǎn)錄蛋白（NF?κB）信號(hào)通路和促分裂素原活化蛋白激酶（MAPK）信號(hào)通路也在腦缺血神經(jīng)細(xì)胞損傷中發(fā)揮著重要的作用［14?15］，是否參與了芍藥苷的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制有待于今后進(jìn)一步的研究。