荷梗對(duì)慢性應(yīng)激小鼠的抗抑郁作用及其對(duì)TPH2 和β CaMKII 表達(dá)的影響

張延紅 曹亞飛 趙亞男 平 鑫 張少丹 裴 林

（1.河北中醫(yī)學(xué)院， 河北 石家莊050031； 2.華北理工大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 河北 唐山063000； 3.河北大學(xué)中醫(yī)學(xué)院， 河北 保定071051； 4.河北省中醫(yī)藥科學(xué)院， 河北省濁毒證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河北 石家莊050031）

抑郁癥是一種常見(jiàn)的慢性精神障礙性疾病，嚴(yán)重影響人的思維，情緒和身體健康［1］。據(jù)世界衛(wèi)生組織（WTO）預(yù)測(cè)到2030 年全球?qū)⒂?.5 億人罹患抑郁癥，且抑郁癥在各個(gè)年齡段均可患病，其特點(diǎn)是情緒低落，缺乏活力，睡眠障礙，并在一定程度上伴有生活或工作能力的下降［2］。然而，到目前為止抑郁癥的臨床用藥并沒(méi)有得到令人滿(mǎn)意的效果［3］。

荷梗屬于睡蓮科蓮亞科植物睡蓮的葉柄及花柄，又稱(chēng)藕桿、蓮蓬桿、荷葉梗，味苦，性平，入脾、膀胱經(jīng)，功效通氣寬胸、和胃安胎，主治外感暑濕、胸悶不暢、妊娠嘔吐、胎動(dòng)不安［4］。本課題前期臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明，含有荷梗的中藥復(fù)方具有很好的抗抑郁作用［5］；本研究采用慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和刺激復(fù)制抑郁癥小鼠模型，探索荷梗的抗抑郁效應(yīng)及其可能的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性ICR 小鼠40 只，購(gòu)自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（冀）2018?004，鼠齡7 周左右，體質(zhì)量（30±5）g。

1.2 試劑與藥物 荷梗（批號(hào)180901）由河北中醫(yī)藥科學(xué)院附屬醫(yī)院提供，經(jīng)河北省師范大學(xué)趙建成教授鑒定為正品，稱(chēng)定100 g 于10 倍量蒸餾水中浸泡1 h，溫火煎煮2次，每次25～30 min，2 次濾液混勻后濃縮至生藥量2、1 g／mL，再次過(guò)濾、分裝，4 ℃保存?zhèn)溆茫环?汀片（20 mg，法國(guó)生產(chǎn)，禮來(lái)蘇州制藥有限公司分裝，批號(hào)J20170022）。Anti?TPH2 antibody（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)ab6336）；Anti?β CaMKII antibody（英國(guó)Abcam 公司，批號(hào)ab1806）；PV?9001 兔二步法檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K182430C）；PV?9003 山羊二步法檢測(cè)試劑盒（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，批號(hào)K1824231）。

1.3 儀器 CX41 生物顯微鏡（日本Olympus 公司）；RM2245 旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）。

2 方法

2.1 小鼠抑郁模型制備 參照前期實(shí)驗(yàn)方法［6］稍作改良。除正常組外共用14 種應(yīng)激刺激方法，分別為晝夜顛倒24 h、束縛2 h、禁食24 h、噪音2 h、禁水24 h、傾斜24 h、空籠24 h、冰水游泳5 min、異味24 h（每周不同）、搖晃5 min、潮濕24 h、熱水游泳5 min、夾尾1 min、異物24 h（每周不同）。每天隨機(jī)選取2 種進(jìn)行，刺激方式不可預(yù)見(jiàn)，持續(xù)21 d。

2.2 分組、給藥 適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，小鼠根據(jù)糖水偏愛(ài)分?jǐn)?shù)隨機(jī)分為正常組、模型組、氟西汀組及荷梗低、高劑量組，每組8 只。造模結(jié)束后，正常組和模型組給予生理鹽水灌胃，陽(yáng)性對(duì)照組給予氟西汀（10 mg／kg）灌胃，荷梗高、低劑量濃度比為2 ∶1，分別為0.4、0.2 g／kg，每天1 次，給藥21 d。

2.3 糖水偏愛(ài)實(shí)驗(yàn) 參照前期文獻(xiàn)報(bào)道，稍作改良［7］。小鼠在適應(yīng)性飼養(yǎng)期間進(jìn)行糖水訓(xùn)練，第1 天每籠均放2 瓶1%蔗糖水，第2 天一瓶為1%蔗糖水，一瓶為純水，之后禁食禁水24 h，第4 天給予一瓶1% 蔗糖水、一瓶純水，24 h后測(cè)糖水消耗，計(jì)算糖水偏好，公式為糖水偏好＝（糖水消耗／總液體消耗）×100%，正式實(shí)驗(yàn)于給藥21 d 后檢測(cè)。

2.4 強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn) 強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)是參照Lin 等［8］的實(shí)驗(yàn)方法設(shè)計(jì)。在正式測(cè)試前1 d，小鼠放入高50 cm、長(zhǎng)20 cm 的玻璃器皿（水溫25 ℃左右）中適應(yīng)性游泳訓(xùn)練15 min，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)記錄6 min 內(nèi)出現(xiàn)靜止不動(dòng)的潛伏期和靜止不動(dòng)時(shí)間（后4 min），靜止的標(biāo)準(zhǔn)是小鼠僅有頭部露出水面，或只做為保持平衡四肢微微波動(dòng)的動(dòng)作。

2.5 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 參照前人研究［9］，曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)需在安靜、光線(xiàn)暗的環(huán)境中進(jìn)行。在正式試驗(yàn)前，所有小鼠均需在曠場(chǎng)（60 cm×60 cm，正方形底面等分成5 cm×5 cm 方格）內(nèi)適應(yīng)1 h，正式實(shí)驗(yàn)時(shí)從曠場(chǎng)中央?yún)^(qū)域放入，由動(dòng)物行為分析系統(tǒng)記錄5 min 內(nèi)小鼠在中央?yún)^(qū)累計(jì)行走距離、在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間和反復(fù)進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)。

2.6 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，所有小鼠用10%水合氯醛（5 mg／kg）腹腔麻醉，生理鹽水透心灌流至肝臟發(fā)白后用4%多聚甲醛灌注，取全腦組織用于免疫組化，石蠟切片透明、脫蠟至水，經(jīng)微波加熱抗原修復(fù)，山羊血清室溫封閉30 min，分別對(duì)應(yīng)腦部位滴加Anti?TPH2抗體（1 ∶300）和Anti?β CaMKII 抗體（1 ∶200），置于4 ℃冰箱中12 h，PBS 洗3 次，5 min／次，分別對(duì)應(yīng)滴加山羊抗兔IgG 和兔抗山羊IgG（二抗稀釋倍數(shù)均為1 ∶200），室溫下孵育30 min，PBS 溶液沖洗3 次，5 min／次，DAB顯色反應(yīng)3～5 min，水洗10 min 終止反應(yīng)，蘇木精復(fù)染，梯度酒精脫水，封片，CX41 顯微照相系統(tǒng)觀察，每只小鼠取5 張腦片，計(jì)數(shù)各組中縫背核TPH2 和外側(cè)韁核CaMKII β 的免疫陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行處理，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析；兩兩比較如果方差齊則采用SNK?q 檢驗(yàn)，如果方差不齊則采用Kruskal?Wallis 非參數(shù)檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 糖水偏愛(ài) 與正常組相比，模型組糖水偏愛(ài)分?jǐn)?shù)減少（P＜0.01）；與模型組相比，氟西汀組及荷梗高劑量組糖水偏愛(ài)分?jǐn)?shù)增加（P＜0.01），而且荷梗劑高劑量組與氟西汀組相比無(wú)差異（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠糖水偏愛(ài)分?jǐn)?shù)的比較（， n＝8）

表1 各組小鼠糖水偏愛(ài)分?jǐn)?shù)的比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.2 強(qiáng)迫游泳 與正常組相比，模型組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間延長(zhǎng)，潛伏期縮短（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組、氟西汀組小鼠迫游泳不動(dòng)時(shí)間縮短，潛伏期延長(zhǎng)（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表2。

表2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間和潛伏期的比較（，n＝8）

表2 各組小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間和潛伏期的比較（，n＝8）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.3 曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn) 與正常組相比，模型組小鼠在中央?yún)^(qū)行走距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間減短，反復(fù)進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)減少（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組、氟西汀組小鼠在中央?yún)^(qū)行走距離、在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間增長(zhǎng)，反復(fù)進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)增加（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 各組小鼠中央?yún)^(qū)行走距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、反復(fù)進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)的比較（， n＝8）

表3 各組小鼠中央?yún)^(qū)行走距離、中央?yún)^(qū)停留時(shí)間、反復(fù)進(jìn)入中央?yún)^(qū)次數(shù)的比較（， n＝8）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.4 相應(yīng)腦區(qū)TPH2、β CaMKII 表達(dá) 與正常組相比，模型組小鼠中縫背核TPH2 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，外側(cè)韁核β CaMKII 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.01）；與模型組相比，荷梗各劑量組和氟西汀組小鼠中縫背核TPH2 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量增多（P＜0.01），外側(cè)韁核βCaMKII 的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少（P＜0.05）。見(jiàn)表4、圖1。

4 討論

一般認(rèn)為，應(yīng)激是誘發(fā)抑郁癥的一個(gè)重要因素，慢性不可預(yù)見(jiàn)性溫和刺激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）［10］建立小鼠的抑郁模型是一種常見(jiàn)的動(dòng)物模型，該模型動(dòng)物的行為表現(xiàn)與人類(lèi)抑郁癥的表現(xiàn)高度相似。本研究觀察到，模型組小鼠的糖水偏愛(ài)分?jǐn)?shù)顯著降低，證實(shí)造模成功，且模型組小鼠的強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間明顯增加，強(qiáng)迫游泳潛伏期顯著縮短，用臨床上公認(rèn)的西藥氟西汀作為陽(yáng)性對(duì)照藥，來(lái)驗(yàn)證中藥荷梗的抗抑郁作用。曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)可檢測(cè)小鼠在新異環(huán)境中的探究行為、緊張恐懼狀態(tài)和對(duì)新環(huán)境的警覺(jué)性。本研究中，運(yùn)動(dòng)能力和探索行為能力的下降是抑郁癥小鼠出現(xiàn)的典型表現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，與模型組相比，中藥荷梗組尤其高劑量組小鼠在中央?yún)^(qū)累計(jì)行走距離及在中央?yún)^(qū)停留時(shí)間顯著增長(zhǎng)，反復(fù)進(jìn)入中央?yún)^(qū)的次數(shù)顯著增多，且與氟西汀組相當(dāng)，說(shuō)明荷梗可以改善動(dòng)物抑郁樣行為和認(rèn)知。

表4 各組小鼠TPH2、β CaMKII 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較（， n＝8）

表4 各組小鼠TPH2、β CaMKII 陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的比較（， n＝8）

注：與正常組相比，??P ＜0.01；與模型組相比，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖1 各組小鼠TPH2、β CaMKII 表達(dá)（免疫組化染色，×200）

研究表明，5?羥色胺（5?HT）系統(tǒng)異常與抑郁癥、焦慮癥、厭食癥、失眠、晝夜節(jié)律紊亂、內(nèi)分泌功能障礙等密切相關(guān)［11］。色氨酸羥化酶（TPH）是5?HT 合成途徑中的限速酶，色氨酸羥化酶2（TPH2）是色氨酸羥化酶（TPH）的一個(gè)亞型，是5?TH 神經(jīng)元的特異性標(biāo)志物之一［12］。據(jù)報(bào)道，TPH2 在中縫背核（DRN）中特異性表達(dá)，其含量減少會(huì)直接影響5?TH 的代謝功能，導(dǎo)致情感障礙和自殺行為［13］。韁核是邊緣前腦和邊緣中腦聯(lián)系的重要節(jié)點(diǎn)，可分為內(nèi)側(cè)韁核（Medial habenula，MHb）和外側(cè)韁核（Lateral habenula，LHb）。鈣／鈣調(diào)蛋白依賴(lài)性蛋白激酶II亞單位β（β CaMKII）是一種鈣依賴(lài)性蛋白激酶，在部位表達(dá)上具有韁核特異性。LHb 和DRN 在調(diào)節(jié)抑郁中發(fā)揮重要作用。這兩個(gè)區(qū)域在結(jié)構(gòu)和功能上有著密切的聯(lián)系。LHb 在應(yīng)激條件下過(guò)度活躍，向下游的投射信號(hào)增強(qiáng)，可直接投射到DRN，抑制5?HT 的釋放，從而導(dǎo)致抑郁的發(fā)生［14］。而LHb 在應(yīng)激條件下被過(guò)度活化，可能是由于突觸前膜谷氨酸釋放增加，上調(diào)β CaMKII，提高興奮性突觸在AMPA 型受體的傳播，而且LHb 可以直接控制DRN，并直接影響多巴胺能和5?HT 能的大腦系統(tǒng)，這些系統(tǒng)涉及多種大腦功能和神經(jīng)精神疾病，比如抑郁癥。目前認(rèn)為韁核是調(diào)節(jié)厭惡行為和逃避行為的關(guān)鍵腦區(qū)，中縫背核是調(diào)節(jié)獎(jiǎng)賞行為的關(guān)鍵腦區(qū)。外側(cè)韁核和中縫背核之間有往返纖維，這表明對(duì)于某種刺激，小鼠選擇厭惡性逃避還是進(jìn)一步探索，可能是上述腦區(qū)協(xié)同調(diào)節(jié)的結(jié)果。如果外側(cè)韁核神經(jīng)元有更多活化，對(duì)中縫背核的抑制可能增加，表現(xiàn)為探索行為減少。反之，獎(jiǎng)賞環(huán)路活化，探索行為增加。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與正常組相比，模型組小鼠腦內(nèi)β CaMKII 的表達(dá)明顯增多，TPH2 的表達(dá)顯著減少，此結(jié)果與之前報(bào)道吻合［15］。與模型組相比，中藥荷梗各劑量組小鼠腦內(nèi)β CaMKII的表達(dá)明顯減少，TPH2 的表達(dá)顯著增多，且荷梗高劑量組的表達(dá)水平與西藥氟西汀組相當(dāng)。由此推斷荷梗的抗抑郁作用機(jī)制可能與調(diào)節(jié)外側(cè)韁核中β CaMKII 及中縫核中TPH2 水平的表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，荷梗對(duì)CUMS 小鼠具有抗抑郁作用，而通過(guò)抑制β CaMKII 的過(guò)度活化，從而減少對(duì)TPH2 的抑制可能是其作用機(jī)制之一。