HPLC 法同時(shí)測(cè)定甘草中3 種成分

靳雪飛 何云嬌 張 杰 施務(wù)務(wù) 葛少波 褚瑞萌

（1.蚌埠市第一人民醫(yī)院中藥房， 安徽 蚌埠233000； 2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部， 安徽 合肥230009）

甘草是臨床常用中藥，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、祛痰止咳、緩急止痛、調(diào)和諸藥的作用，被譽(yù)為“眾藥之王”，甘草苷、甘草酸、甘草次酸是其主要活性成分［1?2］，均為黃酮類(lèi)化合物，具有解毒、抗炎、抗病毒、抗腫瘤等作用，其中甘草苷、甘草酸具有增加免疫、保護(hù)阿爾茨海默腦、抗氧化、抗糖尿病、抗哮喘等活性，而甘草次酸為相對(duì)高效的抗癌成分，具有消炎、抗菌、抗感染、抗病毒、抗HIV、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)毒物耐受等。

現(xiàn)有報(bào)道主要集中于對(duì)甘草有效部位提取分離的研究，以及對(duì)臨床療效的探討，而對(duì)其活性成分準(zhǔn)確測(cè)定的報(bào)道相對(duì)較少，并且也只針對(duì)其中一兩個(gè)化合物，尚無(wú)同時(shí)對(duì)甘草苷、甘草酸、甘草次酸的有效快速定量檢測(cè)。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定甘草中上述3 種成分的含有量，以期為市場(chǎng)上對(duì)該藥材質(zhì)量控制提供依據(jù)，也對(duì)相應(yīng)制劑的制備具有重要意義［3?5］。

1 材料

HP?1100 高效液相色譜儀（北京科瑞邁科技有限責(zé)任公司）。甘草購(gòu)自東營(yíng)市益生堂醫(yī)藥連鎖有限公司（批號(hào)160201、170401、170602），經(jīng)專(zhuān)家鑒定為正品。甘草酸銨、甘草苷、甘草次酸對(duì)照品均由中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)分別為 110731?200407、111610?201005、110723?201715。甲 醇（批 號(hào) 17065013）、乙 腈（批 號(hào)174488）為色譜純（美國(guó)賽默飛世爾科技公司）；醋酸銨（批號(hào)171102）為分析純（廣州市三昌化工有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）?0.03 mmol／L 醋酸銨（B），梯度洗脫，程序見(jiàn)表1；體積流量1.0 mL／min；柱溫28 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)327 μm（0～5 min）、237 nm（5～20 min）；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 梯度洗脫程序

圖1 各成分HPLC 色譜圖

2.2 溶液制備

2.2.1 供試品溶液 精密稱(chēng)取飲片0.2 g，置于100 mL 圓形燒瓶中，加入50%甲醇100 mL，回流提取2 h 后在70 ℃下回收溶劑，放冷，稱(chēng)定質(zhì)量，50%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，混勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對(duì)照品溶液 精密稱(chēng)取甘草酸胺、甘草苷、甘草次酸對(duì)照品適量，50%甲醇溶解稀釋至刻度，即得，每1 mL分別含三者0.04、0.02、0.08 mg（甘草酸含有量＝甘草酸胺含有量／1.020 7）。

2.3 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液5、10、15、20、25、30 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得方程分別為甘草酸Y＝25.841X-14.26（r＝0.998 0）、甘草苷Y＝22.197X＋10.374（r＝0.999 0）、甘草次酸Y＝18.722X-10.928（r＝0.999 0），分別在0.201～1.206、0.113～0.678、0.392～2.352 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系均良好。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液20 μL，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得甘草酸胺、甘草苷、甘草次酸峰面積RSD 分別為0.18%、0.42%、0.87%，表明儀器精密度良好。

2.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液，于0、2、4、6、8、10 h 在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得甘草酸胺、甘草苷、甘草次酸峰面積RSD 分別為0.91%、1.04%、1.48%，表明溶液在10 h 穩(wěn)定性良好。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批飲片，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，測(cè)得甘草酸胺、甘草苷、甘草次酸峰面積RSD 分別為1.38%、1.49%、1.45%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.4 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱(chēng)取各成分含有量已知的飲片6 份，每份0.2 g，置于100 mL 圓形燒瓶中，加入1 mL對(duì)照品溶液，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，甘草酸、甘草苷、甘草次酸平均加樣回收率分別為98.33%、99.43%、98.47%，RSD 分別為0.89%、0.47%、0.65%。

2.4.5 樣品含有量測(cè)定 取3 批飲片，每批6 份，按“2.2.1” 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1” 項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見(jiàn)表2，可知甘草苷、甘草酸含有量均符合2015 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定（分別不低于0.5%、2.0%）。

表2 各成分含有量測(cè)定結(jié)果（n＝6）

3 討論

3.1 供試品溶液制備方法篩選 本實(shí)驗(yàn)考察了50%甲醇、甲醇、50%乙醇，以及加熱回流1、2、3 h 對(duì)各成分提取效果的影響，發(fā)現(xiàn)50%甲醇加熱回流2 h 時(shí)各成分提取較完全，而且雜質(zhì)峰較少，故選擇其作為供試品溶液制備方法。

3.2 色譜條件篩選

3.2.1 色譜柱 本實(shí)驗(yàn)考察了3 種不同廠家的Kromasil C18、YMC?ODS、Agilent SB?C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），結(jié)合方法耐用性、分離度、理論塔板數(shù)、綜合對(duì)稱(chēng)因子等因素，最終選擇Kromasil C18色譜柱。

3.2.2 流動(dòng)相 本實(shí)驗(yàn)以乙腈替代甲醇，趙建軍等［6］報(bào)道它具有更好的洗脫能力。再通過(guò)查閱關(guān)于甘草酸、甘草苷含有量測(cè)定的文獻(xiàn)，選擇乙腈?0.03 mmol／L 醋酸銨作為流動(dòng)相，同時(shí)不斷優(yōu)化其比例，發(fā)現(xiàn)按表1 程序梯度洗脫時(shí)分離效果好，干擾小，出峰時(shí)間短［7］。

3.2.3 檢測(cè)波長(zhǎng) 參照2015 年版《中國(guó)藥典》，本實(shí)驗(yàn)分別以327、237 nm 為第1、第2 檢測(cè)波長(zhǎng)，可提高檢測(cè)的靈敏度和分析效率。

3.3 指標(biāo)成分篩選 甘草為豆科植物，被廣泛用于抗炎、抗心血管疾病、抗病毒［8?9］，其所含甘草酸是重要成分，為無(wú)色柱狀結(jié)晶體；甘草次酸是甘草酸水解成分，具有降壓、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫功能作用，還作為五環(huán)三萜化合物制劑的原料用于抗腫瘤［10］；甘草苷為二氫黃酮類(lèi)化合物，具有抗氧化、清除自由基作用，還能保護(hù)心肌細(xì)胞。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇上述3 種成分作為指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)。

4 結(jié)論

既往關(guān)于甘草的研究大多從單一成分出發(fā)，缺少對(duì)主要化合物的聯(lián)合考察［11?12］，可能會(huì)影響其所含多種有效物質(zhì)的提取效果。因此，本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定甘草中甘草苷、甘草酸、甘草次酸的含有量，該方法快速準(zhǔn)確，重復(fù)性、穩(wěn)定性良好，有助于改進(jìn)該藥材提取工藝，也可為其質(zhì)量控制提供參考。