P356-1Y2L表位刺激BALB/c小鼠的特異性抗腫瘤免疫

賀曉靜 李白煜 賀潔 (開封大學，河南 開封 475000；河南大學)

每年新發肝癌診出約854萬例，成為全球第六大常見癌癥〔1〕。根據美國癌癥協會的數據，美國肝癌的發病率在所有癌癥中增長最快，可能是由于肥胖/糖尿病的增多導致的〔2〕。由于缺乏有效的治療，肝癌是導致成年男性癌癥死亡的第二大原因。激活宿主免疫系統能產生顯著抗腫瘤效果〔3〕。雖然這是很有前景的治療方法，但程序性死亡受體(PD)-1阻斷的抗腫瘤效果取決于腫瘤特異性浸潤性T細胞的存在。除此之外，通過免疫檢查點釋放非特異性免疫可能導致自身免疫破壞。但靶向腫瘤特異性或腫瘤相關抗原的免疫療法很少引起自身免疫疾病〔4〕。研究已經鑒定過肝癌高表達抗原黑色素瘤相關抗原(MAGE)C2有效的人類白細胞抗原(HLA)-A2限制性CD8+細胞素性T細胞(CTL)表位〔5〕，然而，尚不清楚MAGEC2衍生的表位是否能夠引發體內抗腫瘤免疫應答。在荷瘤小鼠模型中用表位肽P356-1Y2L能引起強烈的抗腫瘤反應，可能有助于MAGEC2衍生的表位在抗腫瘤免疫療法中的應用〔6〕。本文擬檢測MAGEC2衍生的免疫原性肽在小鼠體內抗腫瘤免疫效果。

1 材料和方法

1.1材料 T2A2細胞、HepG2細胞(MAGEC2+、HLA-A2+)、H22細胞由開封大學醫學部實驗室常規保存，采用37℃、體積分數5% CO2飽和濕度培養條件下常規培養。6～8周齡Balb/c和昆明小鼠由河南省實驗動物中心提供。表位肽P248-1Y、P356-1Y2L由上海科肽生物科技有限公司合成。青霉素和鏈霉素均購自美國Gibco，Anti-CD8 抗體和Anti-干擾素(IFN)-γ抗體均購自美國的eBioscience品牌。鼠IFN-γ酶聯免疫斑點(ELISPOT)檢測試劑盒購自北京達科為生物技術有限公司，乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自上海碧云天生物技術公司。

1.2抗腫瘤保護模型 選取6～8周齡Balb/c小鼠，每組5只，每間隔10 d(即第0、10和20天)腹腔注射免疫小鼠，每只小鼠由100 μg/ml的肽和不完全弗氏佐劑(IFA)(Sigma-Aldrich，USA)按1∶1乳化。對照組用磷酸鹽緩沖液(PBS)和同體積IFA進行乳化。為了分析誘導特異性CTL，在最后1次免疫后10 d(即第30天)，處死小鼠并將脾細胞在RPMI1640培養基中培養，實驗組加入10 μg的肽。2 d后做為效應細胞鋪于96孔板中，以效靶比50.0∶1，25.0∶1和12.5∶1的比例加入靶細胞(HepG2細胞)，LDH實驗檢測細胞毒活性實驗。在37°C孵育4 h，孵育結束前45 min，將10 μl裂解物加入靶細胞最大釋放組。離心4 min后，將50 μl上清液轉移到另一個96孔板中，每個孔中加入50 μl底物混合物，黑暗中室溫孵育30 min；每孔分別加入50 μl終止液。用酶標儀測量波長490 nm處的OD值。計算公式：殺傷率=(實驗孔值-效應細胞自發釋放值-CTL自發釋放值)/(靶細胞值-效應細胞自發釋放值)×100%〔7〕。

1.3胞內因子染色 收獲上述效應細胞，加入終濃度為10 μg/ml的布雷菲德菌素(BFA)，并在37℃，體積分數5%CO2中孵育6 h。培養完成后，用4%多聚甲醛在4℃下固定20 min，在室溫下用0.1%皂苷處理10 min，并用PBS洗滌。加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記的小鼠CD8抗體(1∶200稀釋)，PE標記的抗小鼠IFN-γ流動單克隆抗體，在4℃下黑暗中孵育30 min，通過離心棄去上清液，將細胞重懸于PBS中，用流式細胞儀檢測〔8〕。

1.4檢測IFN-γ分泌水平 取出ELISPOT條帶，加入200 μl無血清IMDM培養基進行封閉，靜置10 min；誘導的CTL作為效應細胞，T2A2荷肽作為刺激細胞。根據ELISPOT實驗技術說明書進行常規操作。最后將條帶置于通風處，在室溫下進行干燥；使用ELISPOT圖像分析儀計數96孔板的斑點數〔9〕。

1.5治療模式 H22細胞接種于昆明小鼠腹腔，6～8 d可產生腹水，通過腹水進行傳代。1 w后抽取腹水常規培養于含10%胎牛血清的RPMI1640培養基中，置于37℃培養箱中進行培養。調整至1×107個細胞/ml。細胞生長至瓶底70%～80%時既是對數生長期。常規消毒后，在第0天將H22細胞皮下注射到小鼠的背部。當腫瘤長度和寬度約為0.5 cm，在第12天腹腔內注射100 μg/ml乳化后的表位肽。每隔4天免疫1次，出現第1個腫瘤時及時進行測量，游標卡尺每2天測1次，腫瘤體積=0.4×(長度×寬度)2。在31 d的時間里觀察小鼠的存活情況〔10〕。

1.6統計學分析 采用SPSS16.0軟件行方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1ELISPOT檢測多肽免疫BALB/c小鼠分泌的IFN-γ P248-1Y組和P356-1Y2L組分泌的斑點數分別為(64.6±11.5)個和(245.4±109.2)個，顯著高于PBS組的斑點數〔(13.0±4.4)個，P<0.05〕。見圖1。

圖1 候選肽在Balb/c小鼠體內特異性CTL分泌IFN-γ能力的檢測

2.2GLMEEMSAL肽免疫能在BALB/c小鼠中特異性激活T細胞殺傷靶細胞 P356-1Y2L肽刺激的CD8+T淋巴細胞能夠裂解靶細胞，而用P248-1Y肽和PBS刺激的脾細胞顯示出較低的裂解活性。同時，對靶細胞HepG2+BB7.2未顯示出殺傷活性。說明了P248-1Y和P356-1Y2L誘導的特異性CTL殺傷靶細胞具有HLA-A2限制性。見表1。

表1 表位肽免疫BALB/c小鼠CD8+T淋巴細胞的細胞毒活性

2.3胞內因子染色檢測多肽免疫BALB/c小鼠誘導CTL的能力 P248-1Y和P356-1Y2L組CD8+T細胞能分泌IFN-γ水平分別為(1.84±0.22)%、(3.56±0.25)%，顯著高于PBS表位組〔(0.78±0.16)%,P<0.05〕。見圖2。

圖2 胞內因子染色檢測表位肽體內誘導CTL分泌IFN-γ的能力

2.4P356-1Y2L肽免疫抑制BALB/c小鼠腫瘤生長 在實驗結束時，P356-1Y2L組與PBS相比，腫瘤生長減少高達40%。見圖3。

2.5表位肽P356-1Y2L提高了荷瘤小鼠的生存期 與表位肽可以抑制BALB/c小鼠腫瘤生長一樣，表位肽亦可提高荷瘤小鼠的生存期。相對于PBS組接受表位肽P356-1Y2L的免疫荷瘤小鼠的存活率顯著升高(P<0.05)。見圖4。

圖3 BALB/c小鼠腫瘤模型中表位肽的抗腫瘤作用

圖4 多肽免疫可增強荷瘤小鼠生存期

3 討 論

肝癌的發生發展是從患者患有慢性炎癥或肝硬化的非癌性肝病變逐漸發展成肝癌的，并且這些病變不能通過藥物治療來治愈或根除〔11〕。通過預防非癌性肝臟病變進展為肝癌及減輕腫瘤負擔，免疫療法可有效用于肝癌治療并且預防疾病的發展〔4〕。然而，腫瘤免疫在腫瘤部位經常被抑制，特別是在易于表現出免疫耐受的肝臟微環境中，通過門靜脈對已暴露的抗原減少異常免疫應答。目前，癌癥免疫療法采用兩種不同的策略，增強效應細胞功能和釋放免疫抑制性腫瘤微環境〔12〕。

人們普遍認為，多肽具有許多非常有吸引力的優點，包括有利的藥代動力學特征和組織分布模式，血液的快速清除，低毒性和免疫原性及具有良好的溶解性〔13〕。鑒定和開發具有抗腫瘤特性的新型生物活性肽，為癌癥的預防和治療提供了良好的機會〔14〕。目前，多肽的從頭設計和合成是抗腫瘤肽的主要來源形式，可以通過抑制腫瘤血管生成發揮有效的抗腫瘤活性。隨著對癌癥中涉及的蛋白質的結構、功能和相互作用的進一步研究，將發現越來越多可以特異性結合這些蛋白質的多肽〔15〕。在癌癥治療過程中，抗腫瘤肽面臨著許多的治療挑戰，包括穩定性差、膜通透性低和容易被蛋白酶水解消化〔16〕。為了解決這些問題，已經廣泛采用了3種不同類型的修飾策略，包括氨基酸取代，功能肽的結構融合和與化學治療藥物的綴合，并且已被證明在體內外活性實驗中是有效的〔17〕。

基于T細胞的特異性免疫療法被認為是最有希望的腫瘤治療策略之一。CTL能夠識別源自主要組織相容性復合物(MHC)Ⅰ類分子上呈遞的腫瘤相關抗原(TAA)的表位肽，隨后對腫瘤細胞進行裂解。人體中有效的腫瘤免疫是與針對腫瘤抗原CTL的存在有關，腫瘤抗原是一類源自腫瘤特異性抗原或TAA的HLA結合肽〔18〕。由于大多數TAA是自身抗原，在癌癥患者中，靶向腫瘤相關自身抗原的特異性CTL由于胸腺耗竭而不常見，并且在產生抗體免疫應答方面效果不佳。所以需要用特殊的手段去提高表位肽的免疫原性〔19〕。此外，在臨床研究中，已經有增強表位的免疫原性去誘導特異性的CTLs令人鼓舞的結果〔20～23〕。在實驗中本文觀察到用肽P356-1Y2L免疫BALB/c能夠誘導識別和裂解腫瘤細胞CTL的活化。此外，本研究表明在體內使用MAGEC2衍生的表位提供抗腫瘤免疫治療方案，可抑制腫瘤生長并延長小鼠的生存期。

在基于肽的免疫療法的臨床試驗中，已經證明腫瘤抗原衍生的肽可以成功地誘導針對癌癥的抗原特異性CTL〔24〕。本研究證明了對HLA-A2+具有高親和力的MAGEC2衍生表位P356-1Y2L可誘導BALB/c小鼠中的抗腫瘤CTL反應。