塞來昔布對血管緊張素Ⅱ誘導的心肌肥大及MAPK/ERK通路的影響

鄭香妮 侯敏

(1慶陽市人民醫院心血管內科，甘肅 慶陽 74500；2武漢市東西湖區人民醫院心血管內科)

心肌細胞肥大表現為細胞表面積增加和細胞中總蛋白合成增加，心臟通過心肌細胞肥大增加心輸出量，是病理初期一種強有力的代償形式，但持續的心肌肥大會引起心肌收縮功能紊亂、心室重構等，最終導致心力衰竭而威脅患者生命健康〔1,2〕。因此抑制心肌肥大對改善心功能具有重要臨床意義。研究表明，環氧化酶-2抑制劑可通過影響血壓、氧化應激等抑制心肌肥大，塞來昔布作為環氧化酶-2抑制劑的一種，塞來昔布可能在心肌肥大臨床輔助治療中發揮有效作用〔3,4〕。但其抑制心肌肥大的作用機制尚不完全清楚。本研究利用血管緊張素(Ang)Ⅱ誘導大鼠心肌細胞肥大，觀察塞來昔布對心肌細胞表面積、總蛋白濃度及細胞凋亡率的影響，并探討其對細胞中絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/細胞外調節蛋白激酶(ERK)通路的影響。

1 材料與方法

1.1細胞系及主要試劑 大鼠心肌細胞系H9c2(北納生物，編號：BNCC337766)，塞來昔布(美國輝瑞公司，批號：J20120063)，AngⅡ(美國Sigma公司，純度>98%)，胎牛血清和DMEM培養基(美國Gibco公司)。

1.2細胞培養 取H9c2細胞在37℃水浴快速解凍，加入5 ml DMEM培養基重懸細胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入培養基重懸細胞后，轉入含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中，加入100 kIU/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，放于37℃，5%CO2的無菌恒溫培養箱中培養過夜。當細胞融合達到90%以上時，進行細胞傳代。棄培養基，使用適量磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液沖洗細胞后，加入1 ml 0.25%胰酶消化細胞，顯微鏡下觀察到細胞變圓，有細胞開始脫離瓶壁時，加入5 ml DMEM培養基終止消化。將細胞移入無菌離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，重懸細胞后，轉入含10%胎牛血清的DMEM完全培養基中，放于37℃，5%CO2的無菌恒溫培養箱中培養。

1.3藥物處理及分組 取上述傳代后對數生長期的細胞，以1×104個/孔的密度加入96孔板中，以6×105個/皿的密度加入10 cm細胞培養皿中，將細胞分為5組：空白組(未加任何藥物處理)；AngⅡ組(加入1 μmol/L的AngⅡ誘導心肌肥大)；AngⅡ+塞來昔布50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L組(先加入1 μmol/L的AngⅡ誘導心肌肥大，后分別加入塞來昔布50 mg/L、100 mg/L、150 mg/L處理)。各組細胞放于37℃，5%CO2的無菌恒溫培養箱中繼續培養48 h用于后續實驗。

1.4細胞形態學觀察及細胞表面積測定 棄掉96孔板中細胞培養液，加入PBS沖洗細胞后，在奧林巴斯CKX53倒置顯微鏡下觀察細胞形態學變化。每孔加入100 μl的0.1%Triton溶液，室溫作用5 min以增加細胞膜通透性，吸去Triton溶液，加入PBS沖洗3次。每孔加入100 μl的1%牛血清白蛋白(BSA)溶液，37℃下封閉30 min。吸去BSA溶液，加入50 μl BSA溶液稀釋的β-肌動蛋白(β-actin)抗體一抗(Abcam公司)，以PBS代替一抗作為陰性對照，4℃孵育過夜，清洗細胞后，加入50 μl BSA溶液稀釋的羅丹明標記二抗(Abcam公司)，室溫避光孵育1 h。洗滌細胞，加入50 μl 4，6-聯脒-2-苯基吲哚(DAPI)溶液室溫避光染色10 min，清洗細胞，在熒光顯微鏡下觀察并拍照，隨機選擇10個細胞，使用NIH圖像分析軟件計算細胞表面積。

1.5細胞總蛋白濃度測定 收集各組細胞，加入放射免疫沉淀法(RIPA)裂解液(碧云天生物技術研究所)震蕩混勻，冰上放置30 min，12 000 r/min離心10 min，吸取上清液加入新的無菌離心管中，使用二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)檢測各組細胞中總蛋白濃度。

1.6細胞凋亡測定 棄掉96孔板中細胞培養液，加入PBS沖洗細胞后，加入預冷的20%乙醇固定24 h，離心收集細胞并用PBS沖洗3次。參照Annexin-V/碘化丙啶(PI)試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)說明，先加入預冷的結合緩沖液重懸細胞，再分別加入5 μl Annexin-V和10 μl PI渦旋混勻，室溫避光反應10 min。使用BD LSRFortessa X-20流式細胞儀(New Discovery公司)檢測各組細胞凋亡率。

1.7細胞中p38MAPK、ERK1/2、磷酸化(p)-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達檢測 收集培養皿中細胞，加入預冷的PBS反復沖洗2次，加入1 ml RIPA裂解液吸打混勻，提取細胞總蛋白，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離目的蛋白，低溫下轉至聚偏氟乙烯(PVDF)膜后，封閉2 h。加入1∶1 000稀釋后的p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK抗體一抗(Abcam公司)，4℃孵育過夜。加入1∶5 000稀釋的辣根過氧化酶標記二抗(Abcam公司)，室溫孵育1 h，PBS洗膜3次。加入電化學發光液(北京索萊寶科技有限公司)中顯色后，放入GelDoc-ItT S3全自動凝膠成像系統(美國UVP)下曝光、拍照。以GAPDH為對照，應用Image J軟件分析各組細胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達量。

1.8統計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1塞來昔布對細胞形態學的影響 正常H9c2心肌細胞呈肌細胞樣貼壁生長，與空白組比較，AngⅡ組細胞形態增大，不規則排列，細胞貼壁不牢，漂浮細胞增多；與AngⅡ組比較，塞來昔布各處理組細胞形態變小，漂浮細胞減少。見圖1。

2.2塞來昔布對細胞表面積的影響 與空白組比較，AngⅡ組細胞表面積明顯增大(P<0.05)；與AngⅡ組比較，塞來昔布處理各組細胞表面積明顯減小(P<0.05)；AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和塞萊昔布100 mg/L組細胞表面積比較差異無統計學意義(P>0.05)，但均顯著大于空白組(P<0.05)；與AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組比較，AngⅡ+塞來昔布150 mg/L組細胞表面積明顯減小(P<0.05)，與空白組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖2和表1。

2.3塞來昔布對細胞中總蛋白濃度的影響 與空白組比較，AngⅡ組細胞中總蛋白濃度明顯升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較，塞來昔布處理各組細胞中總蛋白濃度明顯降低(P<0.05)；AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組細胞中總蛋白濃度比較差異無統計學意義(P>0.05)，但均高于空白組(P<0.05)；AngⅡ+塞來昔布150 mg/L組細胞中總蛋白濃度較AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組明顯降低(P<0.05)，與空白組比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.4塞來昔布對細胞凋亡率的影響 與空白組比較，AngⅡ組細胞凋亡率明顯升高(P<0.05)；與AngⅡ組比較，塞來昔布各處理組細胞凋亡率明顯降低(P<0.05)；隨塞來昔布濃度增加，細胞凋亡率呈逐漸降低趨勢(P<0.05)。見表1和圖3。

2.5塞來昔布對細胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白表達的影響 與空白組比較，AngⅡ組細胞中p38MAPK、ERK1/2蛋白相對表達量差異無統計學意義(P>0.05)，但p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達量均明顯降低(P<0.05)；與AngⅡ組比較，塞來昔布各處理組細胞中p38MAPK、ERK1/2蛋白相對表達量差異無統學意義(P>0.05)，但p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達量均明顯增加(P<0.05)，且AngⅡ+塞來昔布150 mg/L組細胞中p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達量明顯高于AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組和AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組(P<0.05)。見表2和圖4。

圖1 細胞形態學變化(×100)

圖2 細胞熒光染色(DAPI，×400)

表1 各組細胞表面積、總蛋白含量及細胞凋亡率比較

圖3 細胞凋亡流式細胞圖

表2 各組細胞中p38MAPK、ERK1/2、p-ERK1/2、p-p38MAPK蛋白相對表達量比較

1～5：空白組；AngⅡ組；AngⅡ+塞來昔布50 mg/L組;AngⅡ+塞來昔布100 mg/L組;AngⅡ+塞來昔布150 mg/L組

3 討 論

機械刺激、化學等因素刺激下均可導致心肌蛋白合成增加，心肌細胞體積增大，而發生心肌肥大，研究表明，心肌肥大是許多心血管疾病發生發展過程中共有的病理過程，是導致心力衰竭的獨立危險因素〔5,6〕。研究表明，靶向心肌肥大是預防及治療心力衰竭的新的有效手段〔7〕。AngⅡ是調節血壓和體液的重要激素，可通過升高血壓或直接刺激心肌細胞合成肌蛋白增加，誘導心肌細胞肥大〔8,9〕。

塞來昔布是一種環氧化酶2抑制劑，動物實驗表明，心肌細胞環氧化酶2的高表達可導致心肌肥厚顯著增加，而塞來昔布治療可不同程度緩解心肌肥大及心肌收縮功能障礙，延緩心肌肥大向心力衰竭轉變，降低死亡率〔10,11〕。本研究說明塞來昔布對AngⅡ誘導的心肌細胞肥大具有抑制作用，與Wang等〔12〕研究結果基本一致。進一步分析說明塞來昔布對心肌肥大的抑制具有劑量依賴性，

心肌細胞肥大凋亡、心肌纖維化導致心肌收縮和舒張功能障礙，心室順應性增加是慢性心力衰竭的重要病理改變〔13,14〕。Zhang等〔15〕研究報道，塞來昔布通過減少細胞凋亡、降低炎癥反應和氧化應激水平，抑制壓力超載誘導的心肌肥大。本研究提示塞來昔布可能通過抑制心肌細胞凋亡而抑制心肌肥大。p38MAPK和ERK1/2是MAPK/ERK信號通路的主要組成部分，MAPK/ERK信號通路是介導細胞增殖、細胞分化、細胞周期和細胞凋亡的重要信號系統〔16,17〕。本研究提示塞來昔布可促進p38MAPK和ERK1/2磷酸化，激活MAPK/ERK信號通路，這可能與塞來昔布抑制心肌細胞凋亡有關。

綜上，塞來昔布能夠抑制AngⅡ誘導的心肌細胞表面積增大，蛋白生成，有效抑制心肌細胞肥大。此外其可能通過促進心肌細胞中p38MAPK、ERK1/2磷酸化，激活MAPK/ERK信號通路，抑制心肌細胞凋亡，在抑制心肌肥大進展過程中發揮重要作用。