高危型HPV感染老年宮頸癌患者HPV水平與宮頸局部免疫功能的相關性

鄭淑敏 章麗 (德州市人民醫院婦產科，山東 德州 253000)

宮頸部疾病是婦科常見疾病之一，其中宮頸癌位居第二位，且近年來，其發病率呈不斷上升趨勢，嚴重威脅全球女性的生命安全，現階段已成為公共衛生亟待解決的問題〔1〕。相關流行病學顯示，宮頸癌的發病主要與人乳頭瘤病毒(HPV)感染、長期口服避孕藥、性行為等因素有關〔2〕。HPV屬于DNA病毒，對皮膚與黏膜上皮均會造成感染，主要依靠性行為傳播，人類是其唯一宿主，高危型HPV感染常導致患者罹患宮頸癌的風險增加〔3〕。但是僅僅感染HPV，常不足以進展為宮頸癌，此外免疫性疾病、機體微環境改變等均是致癌因素〔4〕。體液免疫包括CD56+等，細胞免疫主要是由淋巴細胞介導，成熟的T淋巴細胞只表達CD4+與CD8+T淋巴細胞，其中CD4+淋巴細胞被活化后成為輔助性T細胞，CD8+淋巴細被活化后成為具有毒性的T細胞，對靶細胞具有特異性殺傷力〔5，6〕。故臨床常用CD4+、CD8+、CD4+/CD8+來反映組織或協同局部細胞免疫情況。目前臨床關于探究高危型HPV感染的宮頸癌患者體內HPV水平與局部免疫功能之間相關性的研究較少。本研究分析高危型HPV感染的老年宮頸癌患者HPV水平與宮頸局部免疫功能之間的相關性。

1 資料與方法

1.1納入對象 本研究符合醫學倫理委員會制定的相關審核標準，且均在獲得患者及家屬同意后翻閱患者病歷資料。通過整群抽樣法，回顧性分析山東省德州市人民醫院2017年1月至2019年10月明確伴HPV感染的200例宮頸癌患者的臨床資料，并將其納入宮頸癌組，年齡60～78〔平均(69.85±7.23)〕歲；臨床分期：Ⅰ期33例，Ⅱ期78例，Ⅲ期56例，Ⅳ期33例；淋巴結轉移78例，無淋巴結轉移122例。將確診為宮頸上皮內瘤變(CIN)的30例患者臨床資料納入內瘤變組，年齡60～76〔平均(68.98±6.99)〕歲；CIN分期：CINⅠ級7例，CINⅡ級13例，CIN Ⅲ級10例。另外納入同時期內健康體檢為慢性宮頸炎的30例志愿者，并將其納入慢性宮頸炎組，年齡60～80〔平均(69.23±7.11)〕歲。上述3組受試者一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)，研究具有可比性。

1.2入選及排除標準 納入標準：①除了慢性宮頸炎之外，其余患者經病理組織確診，且已明確組織性質及臨床分期與分級；②經熒光定量聚合酶鏈反應明確伴HPV感染；③受試者均有性生活史；④受試者臨床資料完整。排除標準：①入組半年內伴局部或全身免疫增強劑治療；②重要臟器功能受損嚴重者；③伴其他部位惡病質者；④兩組或多重HPV感染；⑤采樣前3 d內陰道未用藥。

1.3采集樣本 采用一次性無菌擴陰器撐開受試者陰道，使宮頸充分暴露，用棉簽輕輕拭去宮頸處的分泌物。采用潮州凱普生物有限公司生產的HPV錐形宮頸刷，在宮頸口順時針旋轉5圈以上后取出，放置在專用細胞保存液的取樣管中，折斷刷柄，蓋好管蓋，并標記好受試者姓名、年齡等一般信息，避免混淆，在取樣過程中注意保護受試者隱私，防止交叉感染，且所有受試者的樣本取樣由同一組婦產科醫師完成。

1.4HPV-DNA檢測方法 采用mRNA抽提與反轉錄試劑盒合成cDNA，利用聚合酶鏈反應擴增進行實時熒光定量檢測步驟與方法嚴格遵循試劑盒說明進行。

1.5宮頸局部免疫指標水平檢測 所有入組受試者于入院次日清晨，空腹狀態下抽取3 ml肘靜脈血，選用由美國BD Biosciences Accuri C6流式細胞檢測儀，采用流式細胞術檢測局部免疫指標水平。具體檢測方法：將血標本置于4℃保存，并在1 h內進行檢測，將淋巴細胞濃度調整至5×106/L利用臺盼藍進行染色，明確活細胞率>85%，取100 μl全血加入測定管中，并加入磷酸鹽緩沖液稀釋至200 μl，再加入流式細胞術專用抗體20 μl搖勻，避光保存在4℃冰箱內30 min，加入紅細胞裂解液裂解。直至出現澄清液體，利用磷酸鹽緩沖液清洗3次后，再次加入0.1%的甲醛溶液固定細胞，2 h后上機檢測。

1.6評價指標 比較3組受試者HPV及宮頸局部免疫功能各指標〔CD8+、調節性細胞(Treg)、CD4+、CD4+/CD8+、CD56+〕水平，并分析HPV水平與宮頸局部免疫功能各指標的相關性。

1.7統計學方法 采用SPSS23.0軟件進行單因素方差分析、χ2檢驗、雙變量Pearson相關性檢驗。

2 結 果

2.1HPV陽性者宮頸局部組織免疫組化染色 見圖1。

2.2各宮頸疾病患者HPV水平及免疫指標水平 HPV、CD8+、Treg水平宮頸癌組>CIN組>慢性宮頸炎組，CD4+、CD4+/CD8+、CD56+水平宮頸癌組

圖1 HPV陽性宮頸局部組織免疫組化染色(DAB，×200)

表1 各組HPV水平及免疫指標水平比較

2.3HPV與各免疫指標之間的相關性 CD4+、CD4+/CD8+、CD56+與HPV之間呈負相關(r=-0.468，-0.252，-0.078，均P<0.001)；CD8+、Treg與HPV之間呈正相關(r=0.221，r=0.180，均P<0.001)。

3 討 論

宮頸癌是婦科常見惡性腫瘤之一，2016年全國腫瘤登記中心發表的相關數據顯示，我國宮頸癌占女性特有惡性腫瘤第二位，且近年來，我國宮頸癌的患病率與死亡率呈逐年上升趨勢〔7〕。目前諸多國家已將對適齡女性的宮頸癌篩查納入國家醫療保障體系，但諸多發展中國家女性的宮頸癌癌前病變篩查并未能有效實施，導致罹患宮頸癌的女性患者仍較多，特別是老年人群，其機體各系統功能低下，機體防御能力較低，罹患宮頸癌的風險較其他人群高，故早發現、早治療對宮頸癌的防治具有重要意義〔8，9〕。

本研究結果表明高危型HPV感染宮頸癌患者HPV水平呈高表達，且HPV水平與宮頸局部免疫功能指標之間關系密切。HPV是一種微小的DNA雙鏈病毒，長約55 nm，含有8 000個堿基對，對皮膚及黏膜上皮均會造成嚴重感染，人類是HPV易感染宿主。HPV的致病機制主要表現在：①HPV-DNA整合、整合位點與宮頸癌之間的關系：宮頸腫瘤早期，HPV16、HPV18 DNA均整合到宿主細胞基因組中，伴隨宮頸局部組織的不斷進展，HPV-DNA整合入宿主的基因不斷增多，而HPV-DNA的高度整合又負性促進宮頸病變的惡性程度，如此形成惡性循環，誘發病情不斷加重〔10，11〕。②HPV E2破壞與宮頸癌之間的關系：E2蛋白是HPV基因組編碼中具有特異性的DNA束縛蛋白，對病毒mRNA的轉錄及DNA賦值具有調控作用，對E6、E7的表達具有負性調節作用；此外，其還能夠通過病毒啟動周圍的基因序列，進而對轉錄過程進行抑制，當E2遭到破壞時，其負反饋調節功能也隨之消失，導致致癌基因E6、E7的高表達，進而導致機體組織發生癌變〔12，13〕。人群在感染HPV之后，通過啟動免疫系統來對HPV感染進行有效清除，機體免疫系統主要包括固有免疫與適應性免疫，其中適應性免疫包括T細胞介導的細胞免疫與漿細胞抗體介導的體液免疫，其中細胞免疫在HPV拮抗方面具有重要意義〔14〕。由T淋巴細胞介導免疫細胞成熟狀態下主要表現為CD8+與CD4+，其中CD4+負責啟動免疫，CD8+執行免疫，被病毒感染的細胞能夠被CD8+直接殺死；CD4+主要分為Th0、Th1、Th2亞型，Th0在抗原刺激下發育為Th1、Th2亞型，并分泌腫瘤壞死因子-α、白細胞介素-4、白細胞介素-6等細胞因子，上述細胞因子均能夠介導機體產生抗體，參與免疫反應；CD8+細胞在各細胞因子的作用下，釋放穿孔素、顆粒酶等，對靶細胞起到殺傷作用〔15，16〕。CD56+主要存在脾臟、血液等部位，屬于自然殺傷細胞的標志物，在沒有致敏淋巴細胞與抗體作用下，CD56+即可對腫瘤靶細胞進行抑制、殺傷〔17〕。Treg在宮頸癌變過程中對免疫系統具有顯著抑制作用，可幫助腫瘤靶細胞逃脫免疫系統監視而繼續存活，導致機體內腫瘤細胞積聚，最終致病〔18〕。

綜上所述，高危型HPV感染的老年宮頸癌患者HPV水平呈高表達，且HPV水平與宮頸局部免疫功能指標之間關系密切，臨床可通過檢測宮頸局部組織免疫指標水平情況，為高危型老年宮頸癌患者的早期診斷與預防提供科學依據。