miR-365對(duì)乳頭狀甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用

靳彤 白曉雪 崔現(xiàn)

(1吉林省腫瘤醫(yī)院甲狀腺微創(chuàng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130000；吉林大學(xué)第一醫(yī)院 2干部病房;3延邊大學(xué)附屬醫(yī)院腫瘤科)

甲狀腺癌是內(nèi)分泌惡性腫瘤中最常見的類型，近年來發(fā)病率逐漸上升。在甲狀腺癌中，乳頭狀甲狀腺癌約占80%。盡管乳頭狀甲狀腺癌患者的5年生存率超過95%，但其容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，可以擴(kuò)散到淋巴結(jié)或遠(yuǎn)處的組織中〔1〕。乳頭狀甲狀腺癌的常規(guī)治療有激素治療、外科手術(shù)及放射性碘消融治療，但這些方法對(duì)轉(zhuǎn)移性病灶無效。因此，迫切需要尋找新型的治療藥物或者藥物靶點(diǎn)。微小RNA(miR)是一類內(nèi)源性的小RNA分子，在人類疾病中起到了重要的調(diào)控作用〔2〕。既往研究顯示，miR-365在乳頭狀甲狀腺癌中表達(dá)低于正常組織〔3〕，但其在乳頭狀甲狀腺癌生物學(xué)功能方面的作用尚未清楚。本研究探討miR-365在體外對(duì)乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移和侵襲性的影響。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞 人的正常甲狀腺細(xì)胞系NTHY-ORI 3-1細(xì)胞和人乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞系TPC-1細(xì)胞購(gòu)買自ATCC公司，培養(yǎng)基為10%胎牛血清的 DMEM 完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37℃含5%CO2的培養(yǎng)箱中，每3天傳代或換液1次。

1.2主要試劑和儀器 高糖DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自Hyclone公司，胎牛血清(FBS)購(gòu)自BI公司，CCK-8試劑購(gòu)自碧云天科技有限公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR Green PCR預(yù)混液購(gòu)自于莫納公司。TRIzol購(gòu)自Invitrogen公司，miR-365 mimic和miR-365抑制劑(inhibitor)及兩者的陰性對(duì)照mimic control和inhibitor control均購(gòu)自廣州銳博。

1.3實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR) 棄去細(xì)胞培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液(PBS)洗后根據(jù)細(xì)胞量加入TRIzol，三氯甲烷抽提，異丙醇沉淀后提取細(xì)胞總RNA，cDNA的合成為20 ng總RNA逆轉(zhuǎn)錄。SYBR Green qPCR Supermix與2.5 μl cDNA、1 μl miR-365特異性引物混合后在伯樂實(shí)時(shí)定量PCR儀中進(jìn)行測(cè)定。以U6為內(nèi)參，采用2-△△CT值的方式定量細(xì)胞中miR-365的表達(dá)。

1.3.2細(xì)胞活性檢測(cè) 消化TPC-1細(xì)胞后，培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液。然后將細(xì)胞種植于96孔板中，每孔2 000個(gè)細(xì)胞。待第二天每孔加20 μl CCK溶液，細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)1～4 h。將細(xì)胞培養(yǎng)板放入酶標(biāo)儀，設(shè)定波長(zhǎng)在450 nm處檢測(cè)孔中的光學(xué)密度(OD)值。

1.3.3細(xì)胞劃痕試驗(yàn) 消化TPC-1細(xì)胞后，培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液。然后將細(xì)胞種植于6孔板中，每孔1×106個(gè)。待第二天細(xì)胞長(zhǎng)滿后，用200 μl移液頭垂直于細(xì)胞培養(yǎng)板底，劃一條直線。用1倍PBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)板，洗去劃下來的細(xì)胞。然后加入無FBS的培養(yǎng)基，將細(xì)胞放入37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)時(shí)間為0 h、24 h和48 h，倒置顯微鏡下拍照。愈合率的計(jì)算公式為，細(xì)胞劃痕的初始寬度減去劃痕的目前寬度然后除以劃痕的初始寬度，得出的小數(shù)換算成百分比。

1.3.4Transwell實(shí)驗(yàn) 在Chamber上室底部中央垂直加入100 μl 溶解的基底膜基質(zhì)，37℃溫育4～5 h使其干成膠狀，將TPC-1細(xì)胞轉(zhuǎn)染后用無血清培養(yǎng)基重懸制成單細(xì)胞懸液。下室加入600～800 μl 含不同濃度血清的培養(yǎng)基，上室加入100～150 μl 細(xì)胞懸液，培養(yǎng)24 h后用800 μl 甲醇固定，800 μl 結(jié)晶紫染色，輕輕用清水沖洗數(shù)次，用用棉棒小心擦拭Transwell室底部膜表面，去除膜上的TPC-1細(xì)胞。用鑷子取下室底膜。在陰涼避光處晾干后，放置在載玻片上，通過中性樹膠封片，在正置顯微鏡下對(duì)膜上的細(xì)胞進(jìn)行拍照并隨機(jī)取6個(gè)視野計(jì)數(shù)細(xì)胞。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用GraphPad Prism7.0軟件進(jìn)行方差分析及q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1miR-365在TPC-1細(xì)胞中的表達(dá) TPC-1細(xì)胞株中miR-365水平(0.37±0.06)明顯低于NTHY-ORI 3-1細(xì)胞(1.00±0.22，P<0.01)。

2.2miR-365對(duì)TPC-1細(xì)胞增殖能力的影響 與空白組和對(duì)照組比較，miR-365 mimic可明顯降低TPC-1細(xì)胞的增殖率(P<0.01)。相反，miR-365 inhibitor可明顯增加TPC-1細(xì)胞的增殖率(P<0.01)，miR-365可以調(diào)節(jié)TPC-1細(xì)胞的增殖能力，見表1。

2.3miR-365對(duì)TPC-1細(xì)胞遷移的影響 miR-365轉(zhuǎn)染后24 h的TPC-1細(xì)胞的遷移能力下降，表現(xiàn)為miR-365 mimic組的劃痕修復(fù)率明顯低于空白組與對(duì)照組(P<0.01)。然而，轉(zhuǎn)染miR-365 inhibitor后，TPC-1細(xì)胞的遷移能力提高，表現(xiàn)為miR-365 mimic組的劃痕修復(fù)率明顯高于空白組與對(duì)照組(P<0.05)，miR-365能顯著抑制TPC-1細(xì)胞的體外遷移能力。見表1。

2.4miR-365對(duì)TPC-1細(xì)胞體外侵襲能力的影響 miR-365轉(zhuǎn)染后24 h的TPC-1細(xì)胞的侵襲能力下降與后，表現(xiàn)為miR-365mimic組的小室膜下的細(xì)胞數(shù)目明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。然而，轉(zhuǎn)染miR-365 inhibitor后，TPC-1細(xì)胞的侵襲能力提高，表現(xiàn)為miR-365 mimic組的小室膜下的細(xì)胞數(shù)目明顯高于對(duì)照組(P<0.01)，miR-365能顯著抑制TPC-1細(xì)胞的體外侵襲能力。見表1。

表1 miR-365 對(duì)TPC-1 細(xì)胞增殖、遷移及侵襲能力的影響

3 討 論

miR是長(zhǎng)約22個(gè)核苷酸的小RNA分子，通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(UTR)結(jié)合負(fù)調(diào)節(jié)基因表達(dá)，從而抑制或破壞轉(zhuǎn)錄本翻譯〔4〕。 研究表明miR參與許多不同的生理和病理過程，如細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、分化及凋亡〔5〕。據(jù)報(bào)道，miR在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)展中發(fā)揮著重要的作用，并且在各種癌癥中起著腫瘤抑制劑或致癌基因的作用〔6,7〕。既往研究發(fā)現(xiàn)一系列致癌和抑制腫瘤的miR，參與人類乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展，這表明miR可以作為乳頭狀甲狀腺癌的診斷標(biāo)志物和治療藥物〔8～10〕。miR-365位于染色體區(qū)域16p13.12。miR-365在各種癌癥類型中的表達(dá)是不同的。miR-365在皮膚鱗狀細(xì)胞癌中高表達(dá)〔11〕。但有報(bào)道m(xù)iR-365在乳頭狀甲狀腺癌組織中呈低表達(dá)〔3〕。本研究結(jié)果與以往的研究結(jié)論一致，提示miR-365可能對(duì)乳頭狀甲狀腺癌的增殖、抗凋亡及轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為有著重要的調(diào)控作用。已發(fā)現(xiàn)miR-365在肝癌中低表達(dá)，并通過直接靶向抗凋亡蛋白Bcl2發(fā)揮誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡的作用〔12〕。另外，發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌中miR-365水平降低，并且miR-365表達(dá)的恢復(fù)抑制了細(xì)胞周期進(jìn)程，促進(jìn)了5-氟尿嘧啶誘導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞系中細(xì)胞凋亡和抑制腫瘤生長(zhǎng)〔13〕。然而，miR-365在調(diào)控乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移過程中的作用尚不清楚。本研究結(jié)果表明miR-365對(duì)TPC-1細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力具有明顯的抑制效應(yīng)。綜上，本研究表明，miR-365在乳頭狀甲狀腺癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，體外過表達(dá)可明顯抑制TPC-1細(xì)胞體外增殖、遷移和侵襲能力。miR-365有望為設(shè)計(jì)乳頭狀甲狀腺癌的新型治療藥物提供理論依據(jù)，為乳頭狀甲狀腺癌的診斷和治療提供新的見解。