反式白藜蘆醇對血管性癡呆模型大鼠海馬神經元的保護作用

吳競婧 徐平

(遵義醫科大學 1第三附屬醫院 遵義市第一人民醫院，貴州 遵義 563000；2附屬醫院神經內科)

血管性癡呆發病率高、病因復雜，主要因缺血性腦卒中及全腦性缺氧缺血導致發病，多數患者伴明顯的偏癱、感覺不適等癥狀，嚴重影響患者的日常生活〔1〕。目前，血管性癡呆的防治仍無特效藥物，臨床上多為患者使用鈣離子拮抗劑、膽堿酯酶抑制劑等治療，但獲得的治療效果均達不到預期〔2〕。隨著現代臨床對中醫藥治療的重視，結合中藥獨有的特性，有醫家指出，可以為血管性癡呆使用中藥治療，具有多靶點、多環節、多方式、副作用少等特點〔3〕。白藜蘆醇藥理作用廣泛，包括抗炎、神經保護、自由基清除、抗氧化、機體損傷保護、影響骨代謝等〔4〕。研究發現，白藜蘆醇可以改善血管性癡呆大鼠空間認知功能損害，通過改善大鼠突觸可塑性來發揮神經保護作用〔5〕。反式白藜蘆醇是白藜蘆醇的一種結構，研究發現，這種反式白藜蘆醇對β-淀粉樣肽(Aβ)致癡呆大鼠海馬旁回有保護作用〔6〕。推測將其用于血管性癡呆的治療也可獲得一定神經元保護作用，但目前國內無相關研究可作為依據支持。本研究探討反式白藜蘆醇對血管性癡呆大鼠海馬神經元的保護作用及可能的機制。

1 材料與方法

1.1動物 SPF級雄性健康SD大鼠，由北京維通利華實驗動物有限公司提供，合格證號為SCXK(京)2018-0010，周齡均為10 w，體重220～260〔平均(240±20)〕g，購回后放于實驗室動物房內飼養。全部動物的采集與處理符合相關文件與文獻中的規定〔7,8〕。

1.2主要用藥與試劑 反式白藜蘆醇，由陜西慈元生物技術有限公司生產提供，純度為98%，批號為20180911；苦味酸，由廣州華拓生物有效公司生產提供；熒光夜、RNAiso試劑液購自大連寶生物公司；DNA聚合酶優化引物、Caspase-3均購自上海生工生物工程有限公司；Aβ25～35由美國Sigma公司提供。

1.3主要儀器 腦立體定位儀，由深圳市瑞沃德生命科技有限公司提供，實時熒光定量PCR分析儀由美國BIO-RAD公司提供，逆轉錄儀由德國EPPENDORF公司提供。

1.4方法

1.4.1血管性癡呆大鼠模型建立 方法〔9〕采用反復夾閉頸雙側總動脈合并腹腔內注射硝普鈉的方式來制作模型。術前禁食12 h，腹腔注射適量的水合氯醛，頸部消毒，做切口將頸動脈分離，硝普鈉腹腔注射。無創動脈夾阻斷雙側頸總動脈血流，10 min后再灌注10 min，重復3次，在傷口上撒適量的青霉素粉末，傷口逐層縫合后回籠保溫飼養。造模后1 d經跳臺實驗評價建模情況〔10〕。

1.4.2分組方法 隨機將全部購入的54只大鼠中10只作為空白對照組，不進行建模；其他44只大鼠均建立血管性癡呆大鼠模型，最終建模成功40只。隨機將建模成功的大鼠分為4組，各組10只，分別為模型組、低劑量反式白藜蘆醇組(低劑量組)、中劑量反式白藜蘆醇組(中劑量組)、高劑量反式白藜蘆醇組(高劑量組)。

1.4.3給藥方法 用0.9%氯化鈉將反式白藜蘆醇溶解為1%的反式白藜蘆醇溶液，建模成功后，開始為大鼠灌胃給藥，低劑量組、中劑量組、高劑量組大鼠的灌胃給藥劑量分別為：10 mg/(kg·d)、20 mg/(kg·d)、40 mg/(kg·d)；空白對照組與模型組給予等體積的氯化鈉注射液，共灌胃給藥10 d。

1.4.4相關指標檢查 (1)取材：在制模后第11天取材：使用10%水合氯醛將大鼠麻醉之后，斷頭、取腦，將大鼠的顱骨打開，迅速將海馬組織取出，并放入滴加RNA萃取的1 ml EP試管內，在-80℃的環境下速凍保存待檢。采用實時定量PCR方法檢測。(2)相關指標檢查：①蘇木素-伊紅染色觀察大鼠海馬病理改變：取大鼠腦組織，經石蠟包埋、切片后行蘇木素-伊紅染色，在光鏡下觀察各組大鼠海馬的病理改變。②使用實時定量PCR測定大鼠海馬區的DNA聚合酶γ及Caspase-3表達。根據試劑盒說明書詳細操作提取并純化DNA，測定DNA含量，進行逆轉錄與擴增。使用相關軟件分析數據，統計目的基因相對表達量。③NMDAR1：a.Western印跡法測定海馬神經元膜蛋白NMDAR1表達：成功分離各組海馬神經元總膜蛋白，加入膜蛋白溶解液溶解，混合上樣緩沖液與等量蛋白樣品，浴鍋加熱10 min，電泳分離后封閉，與NMDAR1抗體、β-actin抗體在4℃條件下反應過夜，洗膜后與羊抗兔IgG室溫下反應，使用軟件分析，得到NMDAR1與β-actin比值，即NMDAR1/β-actin；b.免疫組化測定海馬NMDAR1蛋白表達：石蠟切片脫臘復水，修復后冷卻并沖洗，緩沖液浸泡3次，室溫下孵育，封閉并滴加NMDAR1一抗，孵育過夜沖洗后顯色，滴加二抗，孵育后顯色、復染、脫水、透明、封片。使用光學顯微鏡觀察，陽性表達即棕褐色。使用圖像分析軟件作半定量分析，隨機選取每張切片5個海馬區不重復視野，分別取值并得到平均值，以平均吸光度(IA)積分表示蛋白相對表達量。c.實時定量 PCR測定海馬組織NMDAR1 mRNA表達量。

1.5統計學意義 采用SPSS20.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組海馬組織病理形態 空白對照組海馬區神經元形態、結構均無變化，均正常；模型組大鼠的海馬區細胞層次清晰度不佳且數量明顯變少，胞體縮小明顯，細胞排列較散亂，有神經元丟失及核固縮的情況發生；反式白藜蘆醇使用后，大鼠海馬區細胞層次減少、細胞形態、排列稀松等情況有改善，見圖1。

空白對照組

2.2各組海馬組織Caspase-3、DNA聚合酶γ mRNA表達比較 空白對照組Caspase-3、DNA聚合酶γ mRNA表達最低，后由低至高依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組，模型組最高，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3各組海馬神經元NMDAR1蛋白及mRNA表達比較 空白對照組NMDAR1蛋白及mRNA表達最低，后由低至高依次為高劑量組、中劑量組、低劑量組，模型組最高，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)。見表1，圖2。

表1 各組Caspase-3、DNA聚合酶γmRNA、海馬神經元NMDAR1蛋白及mRNA表達比較

空白對照組

3 討 論

血管性癡呆是主要癡呆類型，是目前唯一證實能夠預防的癡呆類型，早期為患者制定合理干預治療計劃，對逆轉患者病情有重要意義〔11〕。對于血管性癡呆的治療，西醫注重腦卒中的預防，并給予患者神經元保護、腦循環改善、腦代謝改善等諸多方面的治療，以膽堿酯酶抑制劑、鈣離子拮抗劑等為代表〔12〕。這些藥物雖然可以改善患者認知功能，但卻無法有效抑制患者神經細胞的遲發性壞死與繼發性凋亡〔13〕。故血管性癡呆的防治仍是臨床治療的難點與熱點。反式白藜蘆醇是天然多酚類植物保衛素，有著抗老年癡呆、抗腫瘤、抗細菌、抗真菌等諸多生物活性，是理想先導化合物，與反式白藜蘆醇類似物相關的動物實驗中也證實了其具有的理想的生物活性〔14〕。反式白藜蘆醇是白藜蘆醇的主要結構之一，較白藜蘆醇的另一結構——順式白藜蘆醇具有更強的生活性，尤其是在氧化、抗自由基作用方面已被證實并受到認可〔15〕。在2015年，王剛等〔16〕建立了阿爾茨海默病小鼠模型，給予模型反式白藜蘆醇治療，結果顯示，反式白藜蘆醇對阿爾茨海默病小鼠模型的學習記憶改善效果理想，且這種記憶改善效果隨著反式白藜蘆醇使用劑量的增加而增加。上述結果間接反映了反式白藜蘆醇治療血管性癡呆的可能性。Caspase-3是Csapases級聯反應下關鍵的凋亡程度之一，起到最終樞紐的作用；而DNA聚合酶γ則是已知的DNA聚合酶中唯一在線粒體有表達并參與復制、修復線粒體DNA的酶，二者表達的變化與神經元損傷情況有關〔17〕；NMDAR是離子型谷氨酸受體，一方面參加了中樞神經的學習與記憶功能，另一方面參與了腦局部缺氧缺血時谷氨酸的興奮性毒性反應，在腦局部缺血性損傷過程中，其在細胞間隙谷氨酸中過表達為主要表現，激活的NMDAR會導致細胞膜內外離子平衡被破壞，從而誘發神經毒性效應，進一步加重神經細胞損傷程度及死亡〔18〕。可見NMDAR的高表達可能提示神經元的損傷或老化。本研究結果提示反式白藜蘆醇對血管性癡呆患者海馬神經元有保護作用，而這種保護作用可能通過抑制或下調Caspase-3、DNA聚合酶γmRNA與NMDAR1表達來實現。因目前尚無較多研究可以為本研究提供依據，也無較多可作比較的文獻，因此本研究結果的真實性與可靠性可能有偏差，還需要在未來多進行實驗研究加以證實。

綜上所述，反式白藜蘆醇可能通過下調血管性癡呆大鼠海馬區神經元NMDAR1、Caspase-3及DNA聚合酶γ表達，來發揮海馬神經元保護之效。