響應面法優化豆腐柴葉液態酸奶的發酵工藝

李剛鳳，嚴紅波，楊麗娟，楊娟, ，舒亞非，向祝

1. 銅仁學院材料與化學工程學院（銅仁 554300）；2. 福建農林大學食品科學學院（福州 350002）

豆腐柴（Premnɑ microphyllɑTurcz）為馬鞭草科豆腐柴屬灌木，又名斑鳩樹[1-2]。豆腐柴葉中果膠含量30%～40%，可開發豆腐柴果膠類的產品，拓展果膠原料來源[3]。果膠具有良好的凝膠性能，廣泛應用于食品行業，可作為果醬、果凍、酸奶等產品的膠凝劑[4-5]。果膠無味，口感黏滑，能增加產品質感[6]。酸奶富含有益人體健康的活性乳酸菌，其營養豐富和特殊的風味受到人們普遍青睞，成為全球最受消費者喜愛的食品之一[7-8]。乳酸不僅能使腸道里的弱堿性物質轉變成弱酸性物質，還能使代謝產物產生抗菌物質，抑制腸道中腐敗菌的繁殖，從而減少腸道內有害物質的產生，改善腸道功能[9-10]。

中國酸奶的發展速度很快，各種新型酸奶層出不窮，向著風味多樣化、營養強化型及功能性酸奶的方向發展。廖芬等[11]探討不同穩定劑對香蕉凝固型酸奶品質的影響；冷桂華等[12]研究復合穩定劑對凝固型酸奶品質影響；傅訓迅等[13]研究食用淀粉作為穩定劑對凝固型牛蒡蜂蜜酸奶品質影響；田亞紅等[14]利用微生物發酵法提取甘薯渣果膠并應用到凝固型酸奶；楊波等[15]以黃原膠為穩定劑，制得凝固型椰汁酸奶質量穩定。以豆腐柴葉汁和純牛奶為原料制作的液態酸奶鮮見相關報道。基于此，試驗以豆腐柴葉汁和純牛奶為原料，探討豆腐柴葉汁添加量、白砂糖添加量、菌種接種量、黃原膠添加量對豆腐柴葉液態酸奶品質的影響，通過單因素試驗和響應面法優化豆腐柴葉液態酸奶的發酵工藝，研究結果可為豆腐柴葉的開發與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

豆腐柴葉（采摘自貴州省石阡縣坪山鄉佛頂山，鮮葉用包裝袋密封保存于冰箱）；純牛奶（內蒙古伊利實業集團股份有限公司）；嗜熱鏈球菌、保加利亞乳桿菌、長雙歧桿菌、乳雙歧桿菌、短雙歧桿菌、青春雙歧桿菌、兩歧雙歧桿菌、嬰兒雙歧桿菌、嗜熱乳桿菌、羅伊氏乳桿菌（安琪酵母股份有限公司）；白砂糖（市售）。

1.2 主要設備與儀器

JYZ-V902原汁機（九陽股份有限公司）；SRH-S均質機（上海世赫機電設備有限公司）；YLD-6000數顯生化培養箱（金壇市城西崢嶸實驗儀器廠）；PHS-3E pH計（上海佑科儀器有限公司）；BCD-209 NMV冰箱（浙江星星家電股份有限公司）；TG16K-1離心機（長沙東旺試驗儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 豆腐柴葉液態酸奶加工工藝流程

1.3.2 主要操作要點

將清洗干凈的的豆腐柴葉與水按1︰20 g/mL榨汁，將榨好的豆腐柴葉汁，過150目紗布，待用；按一定比例混合豆腐柴汁和純牛奶，在10～20 MPa條件下均質2 min，使乳脂肪球破碎，避免發酵過程及后期儲藏過程中出現脂肪上浮現象；將白砂糖和黃原膠溶于熱水溶化后，添加到混合乳液中，均質5 min，使白砂糖充分溶解；攪拌過程中，黃原膠添加量適量，避免酸奶凝固；采用巴氏滅菌法，85 ℃滅菌15 min，殺菌溫度不宜過高，以免營養物質的損失；將儲存的發酵劑放置室溫活化0.5 h，接種溫度不宜過高，否則會導致發酵劑損失，應冷卻至42 ℃后接種；接種后，置于42 ℃培養箱內發酵6 h；凝乳成液態停止發酵；將發酵后的酸奶迅速降至室溫，于4 ℃冰箱中冷藏24 h[16]。

1.3.3 豆腐柴葉汁添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

總體積為50 mL，分別添加4%，8%，12%，16%和20%的豆腐柴葉汁，按一定比例量取純牛奶與豆腐柴葉汁混合，添加3 g/L黃原膠和80 g/L白砂糖，攪拌均勻、均質，85 ℃滅菌15 min，滅菌后冷卻至42 ℃后接種，菌種接種量0.4%，42 ℃恒溫發酵6 h，后發酵24 h后，分析酸奶感官品質。

1.3.4 白砂糖添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

總體積為50 mL，添加12%豆腐柴葉汁，按一定比例量取純牛奶與豆腐柴葉汁混合，添加3 g/L的黃原膠，分別添加40，60，80，100和120 g/L的白砂糖，攪拌均勻、均質，85 ℃滅菌15 min，滅菌后冷卻至42℃后接種，菌種接種量0.4%，42 ℃恒溫發酵6 h，后發酵24 h后，分析酸奶感官品質。

1.3.5 菌種接種量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

總體積為50 mL，添加12%豆腐柴葉汁，按一定比例量取純牛奶與豆腐柴葉汁混合，添加3 g/L的黃原膠，分別添加80 g/L白砂糖，攪拌均勻、均質，85 ℃滅菌15 min，滅菌后冷卻至42 ℃后接種，菌種接種量為牛奶和豆腐柴葉汁體積的0.2%，0.3%，0.4%，0.5%和0.6%。接種完畢后，42 ℃恒溫發酵6 h，后發酵24 h后，分析酸奶感官品質。

1.3.6 黃原膠的添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

總體積為50 mL，添加12%豆腐柴葉汁，按一定比例量取純牛奶與豆腐柴葉汁混合，分別添加1，2，3，4和5 g/L的黃原膠，添加80 g/L的白砂糖，攪拌均勻、均質，85 ℃滅菌15 min，滅菌后冷卻至42 ℃后接種，菌種接種量0.4%，42 ℃恒溫發酵6 h，后發酵24 h后，分析酸奶感官品質。

1.3.7 豆腐柴葉液態酸奶響應面試驗設計

選用豆腐柴葉汁添加量、白砂糖添加量、菌種接種量和黃原膠添加量為4個考察因素，感官評分為響應值，設計四因素三水平試驗優化豆腐柴葉液態酸奶發酵工藝條件，如表1所示。

表1 響應面分析因素及水平

1.3.8 豆腐柴葉液態酸奶的感官品質測定

豆腐柴葉液態酸奶的感官評價指標包括組織狀態、口感、氣味和色澤等4個方面，由10名專業人員（5男5女）組成的評定小組，滿分為100分，豆腐柴葉液態酸奶感官評價標準見表2。

表2 豆腐柴葉液態酸奶感官評價標準

1.3.9 酸度的測定

酸度測定參照GB 5009.239—2016《食品安全國家標準 食品酸度的測定》[17]。

1.3.10 乳體系穩定性的測定

酸奶乳體系穩定性用離心沉淀率值表示，離心沉淀率值越小，乳體系穩定性越好；離心沉淀率越大，穩定性越差。樣品在3 500 r/min下離心15 min，除去上清液，離心管倒置5 min后，測沉淀物質量，計算其離心沉淀率[18-19]。

1.3.12 數據處理

采用SPSS Statistics 19.0軟件進行統計分析，響應面分析結果用Design-Expert 8.0進行分析。

2 結果與分析

2.1 豆腐柴葉汁添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

由圖1可知，豆腐柴葉汁添加量12%時，酸奶的綜合品質最佳，酸奶呈淡綠色，并有純正的豆腐柴葉特殊香味和奶香味，無乳清析出，酸甜適中。豆腐柴葉汁添加量在4%和8%時，酸奶顏色為乳白色或略帶淡綠色，豆腐柴葉的特殊香味淡；有少量乳清析出，口感不協調；豆腐柴葉汁添加量16%和20%時，酸奶淡綠色加深，豆腐柴葉特殊香味加重；乳清析出增多，口感不協調。隨著豆腐柴葉汁添加，酸奶的發酵受到影響，豆腐柴葉汁添加量12%時對感官評分影響最為顯著，豆腐柴葉汁添加量16%和8%時對感官評分影響顯著（p＜0.05），豆腐柴汁添加量4%時對感官評分影響不顯著。綜合分析，確定豆腐柴葉汁添加量為12%。

圖1 豆腐柴葉汁添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

2.2 白砂糖添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

由圖2可知，加糖量過低時，酸奶的酸度過高，味道過酸，不爽口，濃厚感不強，白砂糖添加量繼續增加時，乳液形成高糖環境，乳酸菌的生長受到抑制。同時，由于乳酸菌的生長受到抑制，風味物質的形成減少，酸度不夠，從而降低了酸奶的品質。豆腐柴葉汁添加量80 g/L時對感官評分影響最為顯著（p＜0.05）且感官評分達到最大，白砂糖添加量100 g/L時對感官評分影響顯著，白砂糖添加量60 g/L時對感官評分影響不顯著，白砂糖添加量40 g/L時對感官評分影響最不顯著。因此，確定白砂糖添加量為80 g/L。

圖2 白砂糖添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

2.3 菌種接種量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

由圖3可知，接種量0.2%和0.3%時，接種量較低，乳酸菌產酸可能受到抑制。接種量增加，有少量乳清析出。酵母菌產酸不穩定，酸奶風味較差。接種量0.4%時，酸奶的味道最好，酸甜適中，色澤均勻，凝乳穩定，綜合品質最佳。接種量0.5%和0.6%時，酸奶風味較差，酵母菌產酸較多，酸味過重，可能原因是菌種之間形成競爭關系，產酸較多較快，酸味增強，菌種的生長受到抑制，感官評分隨著接種量繼續增加逐漸降低。菌種接種量0.4%時對感官評分影響最為顯著（p＜0.05）且感官評分達到最大，菌種接種量0.5%時對感官評分影響顯著，菌種接種量0.3%時對感官評分影響不顯著，菌種接種量0.2%時對感官評分影響最不顯著。因此，確定菌種接種量為0.4%。

圖3 菌種接種量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

2.4 黃原膠添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

由圖4可知，黃原膠添加量為3 g/L時，酸奶的綜合品質最佳，酸甜適中，細膩爽口，濃厚感適宜；無乳清析出，軟硬適度，凝乳均勻。黃原膠添加量為1和2 g/L時，繼續減少黃原膠的添加，酸奶的凝乳不均勻，濃厚感喪失，口感較差。隨著黃原膠添加量減少，乳清析出嚴重，并且伴有沉淀的產生，出現分層。黃原膠添加量為4和5 g/L時，繼續添加黃原膠，酸奶的凝固性和軟硬度增強，口感僵硬，類似果凍類產品。黃原膠添加量為3 g/L時對感官評分影響最為顯著，黃原膠添加量為2和4 g/L時對感官評分影響顯著，黃原膠添加量為5 g/L時對感官評分影響不顯著。因此，確實黃原膠添加量為3 g/L。

圖4 黃原膠添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質的影響

2.5 響應面法優化試驗結果分析

在單因素試驗基礎上，選用豆腐柴葉汁添加量、白砂糖添加量、菌種接種量和黃原膠添加量4個因素為自變量，感官評分為因變量，采用Box-Behnken設計原理對豆腐柴葉液態酸奶發酵工藝參數進行優化，試驗設計及結果如表3所示。

對試驗數據進行分析，結果進行回歸擬合，得到二次回歸方程為：Y=90.20-3.67X1+0.75X2+0.83X3-1.58X4-1.50X1X2+0.25X1X3+3.75X1X4+1.50X2X3-0.25X2X4+2.75X3X4-11.85X12-6.47X22-5.35X32-2.23X4。

由表4可知，回歸模型p=0.004 4＜0.01極顯著，失擬項0.135 3＞0.1，不顯著，說明該試驗能很好地擬合試驗的真實情況，可用于豆腐柴葉液態酸奶發酵工藝的優化。由表4中的p值可知，方程中的X12、X42對Y值均有極顯著影響（p＜0.01），X1、X22、X32對Y值有顯著性影響（p＜0.05）。說明豆腐柴葉汁添加量、白砂糖添加量、菌種接種量和黃原膠添加量對豆腐柴葉液態酸奶感官品質有顯著影響，影響豆腐柴葉液態酸奶感官評分大小的順序為X1＞X4＞X3＞X2。表明試驗因子對響應值不是簡單的線性關系。

各因素交互作用響應曲面分析結果如圖5所示，白砂糖添加量與豆腐柴葉汁添加量對感官評分影響不顯著，白砂糖添加量的感官評分曲線大于豆腐柴葉汁添加量感官評分曲線，說明白砂糖添加量對感官評分的影響大于豆腐柴葉汁添加量；菌種接種量與豆腐柴葉汁添加量對感官評分影響不顯著，菌種接種量的感官評分曲線大于豆腐柴葉汁添加量感官評分曲線，說明菌種接種量對感官評分的影響大于豆腐柴葉汁添加量；菌種接種量與白砂糖添加量對感官評分影響不顯著，白砂糖添加量的感官評分曲線大于菌種接種量感官評分曲線，說明白砂糖添加量對感官評分的影響大于菌種接種量；黃原膠添加量與菌種接種量對感官評分影響不顯著，菌種接種量的感官評分曲線大于黃原膠添加量感官評分曲線，說明菌種接種量對感官評分的影響大于黃原膠添加量；黃原膠添加量與豆腐柴葉汁添加量對感官評分影響不顯著，黃原膠添加量的感官評分曲線大于豆腐柴葉汁添加量感官評分曲線，說明黃原膠添加量對感官評分的影響大于豆腐柴葉汁添加量；隨著各交互因素添加量的增加，豆腐柴葉液態酸奶的感官評分值都呈現先增大后減小趨勢，總體而言，感官評分值變化幅度不大。

表3 響應面試驗設計與結果

經軟件分析，豆腐柴葉液態酸奶最佳工藝參數為：豆腐柴葉汁添加量10.62%、白砂糖添加量83.49 g/L、菌種接種量0.41%、黃原膠添加量2.83 g/L，豆腐柴葉液態酸奶的感官評分值達91.3分，與預測值91.73較接近，說明響應面法優化的結果可信度較大，同時為方便實際操作，選擇豆腐柴葉汁添加量11%、白砂糖添加量83 g/L、菌種接種量0.4%、黃原膠添加量2.8 g/L，酸奶感官評分為91.3分。

表4 回歸方程方差分析表

圖5 各因素交互作用對豆腐柴葉液態酸奶感官品質影響的響應面

2.6 液態酸奶質量指標評定

2.6.1 豆腐柴葉液態酸奶感官指標

豆腐柴葉液態酸奶呈淡綠色，色澤均勻，無乳清析出、無氣泡、軟硬適度、凝乳均勻無分層，酸甜適中，細膩爽口，具有適宜的稠厚感。兼具豆腐柴葉的特殊氣味和酸奶的發酵香味，具有一定的流動性和黏稠性，無其他異味和雜物。

2.6.2 豆腐柴葉液態酸奶理化指標

酸度72 °T，離心沉淀率6.3%，乳體系穩定；酸奶膠體脫水收縮作用敏感性STS為4.2%，表明酸奶凝膠體產生脫水收縮不明顯。

3 結論

通過Box-Behnken設計及響應面優化，確定豆腐柴葉液態酸奶發酵工藝的最佳工藝參數為：豆腐柴葉汁添加量11%、白砂糖添加量83 g/L、菌種接種量0.4%、黃原膠添加量2.8 g/L。此時感官評分91.3分，在此工藝下發酵的豆腐柴葉液態酸奶色澤為淡綠色，表面光滑，流體態，凝乳質地良好，酸度72 °T，離心沉淀率6.3%，乳體系穩定，膠體脫水收縮作用敏感性為4.2%，酸奶膠體脫水收縮作用不敏感，試驗結果可為豆腐柴葉液態酸奶的發酵提供理論參考，為豆腐柴葉的合理開發提供思路。