絮凝法收集異養小球藻

尹永磊 ，畢生雷，楊磊，張乃群*

1. 南陽師范學院生命科學與技術學院（南陽 473061）；2. 河南天冠企業集團有限公司車用生物燃料技術國家重點實驗室（南陽 473000）

藻類食品是既傳統又新穎的食品，繼螺旋藻之后，小球藻、雨生紅球藻也越來越多地被用于保健品，微藻食品受到越來越多關注。異養小球藻生長速度是自養藻的40倍、生物量是自養藻的60倍，而且含油量高、占地面積小、可利用工業發酵裝置進行集約化生產，不僅可用于食品原料，同時也被認為是生產生物柴油的良好原料[1]。微藻收集成本較高，一般占藻粉總成本的1/3[2]。藻類收集方法研究較多的是大型藻類、自養微藻類，規模化收集微藻主要使用工藝和設備均較成熟的離心法，但該方法能耗大、成本高。絮凝法在收集細胞的同時，對細胞傷害極小，絮凝團內的細胞形態完好，游離細胞則可保持良好的活性[3]，對后序提取工藝沒有不良影響，有研究表明絮凝法能夠使自養微藻收集成本降低68.8%[4]。試驗在前人研究基礎上，探索絮凝法收集異養小球藻工藝，以期為規模化應用提供參考。

絮凝法大致可分為無機絮凝法、有機絮凝法、生物絮凝法。薛蓉等[5]研究表明，殼聚糖、瓊脂等有機絮凝劑對自養小球藻沒有任何絮凝作用，無機絮凝劑絮凝效果均比較理想。趙奎等[6]研究8種絮凝劑對自養小球藻的影響，結果表明氫氧化鈣是最理想的絮凝劑，自養小球藻絮凝率可達97%。現有文獻僅涉及異養小球藻的生物絮凝法[2]，其他絮凝法尚未報道。異養小球藻的藻細胞油脂含量達50%以上，但藻蛋白含量僅15%左右，與自養小球藻培養液相比，異養小球藻發酵液生物量較高、發酵液成分復雜，不僅含有培養基中殘留的葡萄糖、酵母粉、營養鹽等物質，還有大量的細胞碎片、膠體、代謝產物等物質，這些物質都是自養小球藻培養液不含有的。因此，直接借鑒以往經驗可能無法獲得理想結果，試驗在綜合比較不同絮凝方法的絮凝效果基礎上，對絮凝率高的方法進行工藝優化，探索適合異養小球藻發酵液的絮凝方法。

1 材料與方法

1.1 材料及設備

異養小球藻（Chlorellɑ protothecoides）藻種（清華大學生命科學院）；異養小球藻發酵液（車用生物燃料技術國家重點實驗室）；異養小球藻發酵液由異養小球藻使用葡萄糖、酵母粉等原料發酵所得，發酵終了生物量為121 g/L、pH 6.3，發酵結束后經100 ℃滅菌、降溫，備用；三氯化鐵、氯化鋁、殼聚糖、陽離子型高分子改性絮凝劑聚丙烯酰胺（簡稱聚丙烯酰胺）、醋酸（均為市售）；黑曲霉（Aspergillus niger 3.3928，車用生物燃料技術國家重點實驗室）。

ME1002E型電子天平（梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司）；WH220-HT數字式加熱磁力攪拌器（伊孚森生物技術（中國）有限公司）；FE28-Bio型pH計（梅特勒-托利多國際貿易（上海）有限公司）；XSP-9CA型顯微鏡（上海光學儀器廠）。

1.2 試驗方法

1.2.1 不同絮凝方法的比較

無機絮凝法和有機絮凝法：取1 000 mL發酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入1.5 g/L三氯化鐵、氯化鋁、殼聚糖、聚丙烯酰胺，在磁力攪拌器上以150 r/min速率攪拌2 min后靜置80 min（添加聚丙烯酰胺的同時需要同時添加醋酸，添加比例為1︰100 g/mL），使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細胞數，參照文獻[6]計算絮凝率。

生物絮凝法：參照文獻[2]在搖瓶發酵液中補充營養物質并接入黑曲霉繼續培養，直到霉菌吸附球不再增加為止，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細胞數，參照文獻[6]計算絮凝率。

1.2.2 絮凝條件優化

絮凝劑添加量對絮凝率的影響：取1 000 mL發酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入0.5，1.0，1.5，2.0和2.5 g/L的聚丙烯酰胺（添加聚丙烯酰胺的同時需要同時添加醋酸，添加比例為1︰100 g/mL），在磁力攪拌器上以150 r/min速率攪拌2 min后靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細胞數，參照文獻[6]計算絮凝率。

攪拌速率對絮凝率的影響：取1 000 mL發酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入2.0 g/L的聚丙烯酰胺（添加聚丙烯酰胺的同時需要同時添加醋酸，添加比例1︰100 g/mL），在磁力攪拌器上以0，100，200，300和400 r/min速率攪拌2 min后靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細胞數，參照文獻[6]計算絮凝率。

攪拌時間對絮凝率的影響：取1 000 mL發酵液，分別置于5個500 mL小燒杯中，并分別加入2.0 g/L聚丙烯酰胺（添加聚丙烯酰胺的同時需要同時添加醋酸，添加比例1︰100 g/mL），在磁力攪拌器上以300 r/min速率攪拌0，10，20，40和80 min后靜置80 min，使用移液槍從燒杯中上部吸取適量液體測定細胞數，參照文獻[6]計算絮凝率。

1.2.3 響應面分析

根據單因素試驗確定的主要影響因素，利用Box-Behnken組合設計的方法對其進行試驗，利用響應面分析方法對結果進行回歸模擬，確定最優絮凝條件。1.2.4 絮凝率的計算

1.2.5 數據分析方法

單因素試驗使用Origin 75軟件繪圖并分析，響應面分析使用Design-Expert 8.0進行分析。

2 結果與討論

2.1 絮凝方法選擇

無機絮凝法可分為鐵系、鋁系，無機絮凝法主要通過釋放離子到細胞表面，通過電中和作用消除細胞表面的靜電斥力，從而使細胞之間由原來的相互排斥變成相互吸引、凝聚成團。有機絮凝法可分為殼聚糖等天然型和聚丙烯酰胺等合成型，通過吸附等作用凝聚細胞。生物絮凝法一般使用真菌、霉菌等菌絲體較長的細胞，霉菌等細胞通過菌絲包裹其他細胞凝聚成團，從而實現細胞的絮凝，也有研究將生物法劃歸到有機絮凝法中。

圖1是不同絮凝方法對異養小球藻的絮凝效果。從圖1可知，霉菌吸附效果最差，僅43.18%，原因可能是異養小球藻發酵時間長、發酵液中成分復雜，霉菌生長狀況不太理想，異養小球藻細胞較小，霉菌絲無法形成致密的菌絲團包裹細胞。三氯化鐵、氯化鋁的絮凝效果略高于霉菌吸附，原因可能是異養小球藻經過十幾天的發酵，發酵液中不僅有大量的代謝產物，還存在膠體、細胞碎片等物質，干擾了無機離子的電中和作用。聚丙烯酰胺絮凝率最高，可能是人工合成的有機絮凝劑攜帶大量的帶電官能團，能夠強烈吸附膠體、細胞，并迅速凝聚成團沉積下來。試驗所用絮凝方法與其他文獻相比略低，可能是異養小球藻發酵液質量體積濃度達121 g/L，遠高于文獻所用自養小球藻的2 g/L，這導致溶液黏度過大、不利于高分子鏈的分散，導致絮凝效果較差[7-9]。

圖1 不同絮凝方法的絮凝率

2.2 工藝參數對絮凝率的影響

影響絮凝的參數有絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間、沉降時間、pH等。對于沉降時間，陳曉燕等[10]研究結果表明，絮凝后沉降一般在10 min內即可完成，絮凝時間對絮凝率影響并不大，而調節pH將會使用額外的酸和堿，絮凝率較高的pH區間也往往處于中性范圍[11]。因此著重考察絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間對絮凝率的影響。

2.2.1 絮凝劑添加量對絮凝率的影響

聚丙烯酰胺是人工合成的高分子有機絮凝劑，它的作用機理是絮凝劑能夠釋放帶電官能團吸附膠體、細胞，從而使細胞橋架成大團并沉降，可見這種絮凝劑實現絮凝效果的前提是能夠與細胞接觸、細胞之間橋架成團。如果絮凝劑添加量較少，絮凝劑不足以吸附全部膠體、細胞，不能聚集成團并沉積，而如果絮凝劑添加量過多，每個細胞都被數個絮凝劑基團吸附、包裹沒有空間去橋架，而絮凝劑基團之間無法橋架，所以細胞之間可能無法實現橋架、無法絮凝成團并沉降[11]。因此合適的絮凝劑添加量不僅與絮凝劑成本有關，還影響著絮凝效果。

圖2是絮凝劑添加量對絮凝率的影響。隨著絮凝劑添加量提高，絮凝率不斷提高，但絮凝劑添加量2 g/L時絮凝率達到68.03%，繼續增加用量絮凝率反而快速下降。趙奎等[6]研究表明，殼聚糖、聚丙烯酰胺的用量越大越好，與試驗結果存在差異，這可能是趙奎等研究所用研究對象是自養藻，培養液中成分簡單，只有水、少量的可溶性無機鹽和藻細胞，另外試驗的絮凝率并沒有達到最大值，從而得出絮凝劑用量越大越好的結論。因此，試驗選擇絮凝劑添加量2 g/L。

圖2 絮凝劑添加量對絮凝率的影響

2.2.2 攪拌速率對絮凝率的影響

攪拌是生化反應中的常用操作，目的是為了使溶液中的各種成分能夠混合均勻，以防局部反應物濃度過高，從而縮短反應時間，提高反應速率。絮凝劑、發酵液均是可溶性物質，但它們之間吸附、橋架作用并不劇烈。因此對攪拌速率需要進一步考察。

圖3是攪拌速率對絮凝率的影響。隨著攪拌速率提高，絮凝率快速提高，說明攪拌使絮凝劑、發酵液在容器中分布均勻、充分接觸，從而在攪拌速率提高時絮凝率也得到相應提高。但攪拌速率超過300 r/min后，絮凝率反而有所下降，這可能是由于攪拌速率過高而產生的剪切力過大，這種作用力超過了絮凝劑與細胞之間的橋架、吸附作用力，從而將部分絮凝團打散、絮凝率下降，試驗結果與陳曉燕等[10]的研究結果相同，因此試驗選擇攪拌速率300 r/min。

2.2.3 攪拌時間對絮凝率的影響

絮凝是一個緩慢的過程，沒有酸堿中和之類的生化反應那樣劇烈，因此絮凝過程需要一定時間。攪拌能讓反應體系中各成分混合均勻、充分接觸，如果攪拌時間過短，就會導致絮凝不完全，絮凝率不理想。

圖4是攪拌時間對絮凝率的影響。隨著攪拌時間增加，絮凝率快速提高，攪拌時間達到20 min后，絮凝率增加速度放慢，攪拌時間達到40 min時絮凝率達到88.93%，繼續增加攪拌時間絮凝率反而有所降低。這說明在合適的剪切力范圍內，隨著絮凝的完成，絮凝團內部結構穩定。陳曉燕等[10]研究表明，使用陽離子淀粉絮凝劑收獲自養斜生柵藻攪拌10 min即可達到最高絮凝率，繼續攪拌將浪費能源，試驗所用攪拌時間較長的原因是生物量高、發酵液成分極其復雜。因此，試驗選擇攪拌時間40 min。

圖3 攪拌速率對絮凝率的影響

圖4 攪拌時間對絮凝率的影響

2.3 響應面分析

根據單因素試驗結果，使用Design-Expert 8.0軟件對絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間3個變量進行Box-Behnken設計（見表1），以絮凝率為響應值進行響應面分析（見表2），利用軟件進行建立回歸模型，并選擇最優變量。

通過軟件分析，進行二次多項式擬合，獲得回歸方程：絮凝率=89-0.75A-1.00B+0.00C+1.00AB+0.00AC+0.50BC-8.50A2-15.00B2-6.50C2。回歸方程的復相關系數的R2為98.72%，校正后的R2為97.09%，說明試驗可靠度高，而變異系數C.V.值為2.29%，說明試驗穩定性強，試驗操作可信，該回歸方程為絮凝法收集異養小球藻提供良好模型。

根據二次回歸模型繪制響應面分析圖，如圖5所示。

表1 因素水平表

圖5 響面分析圖

圖6 絮凝前后對比

從表3可知，絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間對絮凝率影響均不太顯著，絮凝劑添加量、攪拌速率、攪拌時間各變量之間的交互作用不太明顯。二項式模型選擇的最優變量為絮凝劑添加量2.0 g/L、300 r/min、攪拌時間40 min，此時理論絮凝率達到89%，根據最優變量進行驗證，三次重復試驗的平均結果為89.15%，與理論值僅相差0.17%，說明通過響應面分析獲得的絮凝法收集工藝條件是可行的。從圖6可以看出，使用最佳條件進行絮凝，在絮凝后異養小球藻在燒杯底部沉積明顯，收集效果較好，絕大部分細胞沉積，能夠滿足藻細胞收集要求。結果顯示發酵液中上部仍為不透明液體，原因在于培養基和流加補料均使用大量葡萄糖、酵母粉，滅菌以后培養基顏色為深褐色，高含油異養小球藻細胞為米黃色，因此在發酵中后期異養小球藻濃度較高時發酵液偏黃色，但藻細胞沉積后發酵液中上部仍殘留個別細胞、色素等物質，不會像自養藻培養液絮凝后變得透明。

表3 方差分析結果

試驗獲得的最佳工藝條件下絮凝率仍然比傳統離心法所得采收率低，這說明單一絮凝劑的絮凝效果比離心法差，這也是絮凝法在異養小球藻實際生產中應用相對較少的原因之一。彭超等[12]研究表明，復合絮凝劑選擇合適將產生明顯的協同作用，使絮凝率遠高于單一絮凝劑，絮凝效果更好，將在后序試驗中開展進一步研究。

聚丙烯酰胺低毒，但丙烯酰胺單體會對動物神經系統造成損傷，如果收集到的藻粉用于生產保健品、餌料等產品，將影響產品質量，因此，將在后序試驗中進一步研究低毒、無害的收集方法。

3 結論

由于發酵液成分復雜、雜質過多，無機絮凝劑、霉菌吸附均對異養小球藻絮凝效果不太理想，有機絮凝劑顯示出較好的絮凝效果。通過單因素試驗、響應面分析，獲得最優變量：絮凝劑添加量2.0 g/L、300 r/min、攪拌時間40 min，在此條件下進行試驗驗證，絮凝率達到89.15%，回歸分析和驗證試驗均表明響應面分析結果合理、可信。

復合絮凝劑絮凝效果更理想，有待于進一步研究，但在發酵液中添加絮凝劑將改變上清液、藻粉的物質構成，對上清液處理、藻粉制取工藝造成不利影響。新興的磁性粒子絮凝、藻細胞自絮凝等絮凝工藝具有不改變發酵液物質構成、成本低廉等優點，有待于跟蹤研究進展，進行相應技術儲備，低成本、高效率絮凝法新工藝的不斷涌現將推動絮凝法收集微藻細胞的廣泛應用，進而推動微藻產業的進一步發展。