UPLC-QTOF高分辨質譜法定性檢測雞蛋中的斑蝥黃

房艷 *，高俊海 ，于思雨

1. 譜尼測試集團股份有限公司（北京 100095）；2. 譜尼測試集團北京科學技術研究院有限公司（北京 100095）

雞蛋因含有豐富的營養物質而備受大眾青睞，市售雞蛋一般分為自然放養或較大范圍圈養的雞產蛋（土雞蛋）和人工飼料籠養的雞產蛋（洋雞蛋），此外也不乏有機雞蛋、富硒雞蛋等概念蛋。相關研究資料表明，土雞蛋在蛋黃比例、類胡蘿卜素、蛋白質、膽固醇等指標與洋雞蛋具有明顯差異，且大多數往往在表征上體現為蛋黃顏色更深[1-3]。隨著我國經濟水平的不斷提高，人們對雞蛋品質的要求也越來越高。在利益的驅使下，不法商販通過在飼料中超量添加斑蝥黃等著色劑，人為加深雞蛋蛋黃色澤，以增加感官效果及經濟效益。

斑蝥黃（Canthaxanthin，C40H52O2）又稱角黃素，屬于類胡蘿卜素，是加麗素紅的有效成分[4-5]，呈橙紅色，可通過家禽消化道吸收并最終富集于蛋黃[6-7]，是一種較為常用的飼料添加劑。然而，相關研究結果表明斑蝥黃被人體吸收后可能會在視網膜蓄積造成視力減退等[8]，且具有一定的肝損傷性。因此，歐盟規定飼料中斑蝥黃的添加量不得高于25 mg/kg[9]，日本于2006年實施的肯定列表制度中也規定禽蛋等動物源性食品中角黃素最大殘留量為100 μg/kg[10]。

目前，雞蛋中斑蝥黃的檢測方法主要有液相色譜法[11-15]、超高效液相色譜串聯質譜（UPLC-MS/MS）法[16-18]等。此次試驗擬利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF）技術建立一種分辨率更高的斑蝥黃定性檢測方法，對生雞蛋和熟雞蛋進行同步分析，并與標準方法SN/T 2327—2009《進出口動物源性食品中角黃素、蝦青素的檢測方法》中UPLC-MS/MS部分的檢測結果進行比較。

1 材料與方法

1.1 儀器、設備與試劑

Waters Xevo G2-XS QTOF/UPLC系統（配備二極管陣列檢測器PDA，美國Waters公司）；LC-20AD高效液相色譜儀-LCMS-8045質譜儀（日本島津公司）；T18均質機（德國IKA公司）；Vortex-Genie 2渦旋振蕩器（美國Scientific IN.D.ustries公司）；CT15RT高速冷凍離心分離機（中國上海天美生化儀器設備工程有限公司）；N-1100旋轉蒸發儀（日本東京理化器械株式會社）；Millipore-Q超純水凈化儀（美國Millipore-Q公司）；AB135-S分析天平（感量0.1 mg，瑞士METTLER TOLEDO公司）；DZKW-4恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；KH-500E超聲清洗器（中國昆山禾創超聲儀器有限公司）；濾膜（尼龍，0.22 μm，美國Agela Technologies公司）。

斑蝥黃標準物質（純度95%，CAS 517-78-3，中國計量科學研究院）；正己烷（色譜級，純度≥95%，CAS 110-54-3，Hipure chem公司）；正丙醇（分析純，西隴化工股份有限公司）；無水硫酸鈉（分析純，西隴科學股份有限公司）；2, 6-二叔丁基-4-甲基苯酚（BHT，純度99.8%，美國Thermo Fisher公司）；乙酸銨（分析純，西隴科學股份有限公司）；甲酸（分析純，西隴科學股份有限公司）；亮氨酸腦啡肽（分析純，美國Waters公司）；乙腈（質譜級，美國Honeywell Inernational公司）；UPLC-QTOF流動相用水（質譜純，霍尼韋爾貿易（上海）有限公司）；除UPLC-QTOF流動相用途之外的水皆為超純水，經Millipore-Q超純水凈化儀制備；乙腈提取劑（0.25 g BHT溶解于500 mL乙腈）；BHT-乙腈溶液（0.5 g BHT溶解于500 mL乙腈）。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備

取蛋黃并記錄蛋黃顏色（羅氏比色扇法），混勻。其中，取部分為生雞蛋試樣；取部分煮熟后用均質機充分搗碎、混勻，為熟雞蛋試樣。

1.2.2 樣品前處理

稱取約1 g（精確至0.01 g）試樣于50 mL離心管中，加入15 mL乙腈提取劑及10 g無水硫酸鈉，渦旋混勻，在35 ℃以下水浴超聲提取10 min，以3 000 r/min離心5 min。將上清液移入預置有20 mL正己烷的分液漏斗中，振搖后靜置分層；收集下層乙腈相，正己烷相在分液漏斗，待試樣后續脫脂重復使用。按上述步驟對離心管中的殘留物用10 mL乙腈提取劑重復提取，所得提取液用上述正己烷相脫脂。合并2次脫脂后所收集的乙腈相，加入5 mL正丙醇，在40 ℃以下旋轉蒸發濃縮至近干，用乙腈溶解并定容至5.0 mL，經0.22 μm濾膜過濾，濾液待測。

1.2.3 標準溶液的制備

準確稱取斑蝥黃標準物質，用BHT-乙腈溶液溶解并稀釋，制備成質量濃度在0.1～200 ng/mL范圍的標準工作液，供UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS分析。以定量離子對的峰面積為縱坐標，相應的質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，保留時間和碎片離子定性，外標法定量。

1.2.4 儀器條件

1.2.4.1 UPLC-QTOF條件

色譜柱，Acquity UPLC BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣體積，2 μL；流速，0.3 mL/min；柱溫，30 ℃；流動相，乙腈（A）和含0.2%甲酸的5 mmol/L的乙酸銨溶液（B）；梯度洗脫，0～3.4 min，90%～98%（A）；3.4～3.8 min，98%～90%（A）；3.8～5.0 min，90%（A）。

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，MS/MS模式；離子源溫度，115 ℃；脫溶劑氣溫度，340 ℃，氮氣；脫溶劑氣流速，750 L/h；錐孔氣流速，45 L/h，氬氣；毛細管電壓，3.0 kV；錐孔電壓，20 V；碰撞能30 V；四極桿低質量數分辨率，15；實時校正液，亮氨酸腦啡肽（正離子條件m/z 556.277 1）。

1.2.4.2 UPLC-MS/MS條件

色譜柱，Agilent Eclipse Plus C18（50 mm×2.1 mm，1.8 μm）；進樣體積，2 μL；流速，0.4 mL/min；柱溫，40 ℃；流動相，乙腈-0.1%甲酸溶液（92︰8，V/V），等度洗脫5 min。

電噴霧離子源（ESI），正離子掃描，多反應監測（MRM）；離子源溫度，300 ℃；霧化氣、加熱氣、干燥氣，氮氣；碰撞氣，氬氣；霧化氣流量，180 L/h；加熱氣流量，600 L/h；干燥氣流量，600 L/h；DL溫度，250 ℃；加熱模塊溫度，400 ℃；毛細管電壓，3.0 kV；檢測器電壓，1.74 kV；監測離子對及相關MRM參數見表1。

表1 斑蝥黃的MRM參數

2 試驗結果

2.1 QTOF結果分析

QTOF具有極高的分辨率[（FWHM）＞40 000]，可檢測組分并收集精確質量數母離子和碎片離子。相比于UPLC-MS/MS精確化合物質荷比至小數點后2位，QTOF可至小數點后4位且質量精度仍＜10-6，具有極高的可靠性和穩定性。QTOF分析結果表明，在正離子模式下，斑蝥黃的一級質譜以準分子離子峰m/z 565.404 5[M+H]為基峰，主要碎片離子為m/z 133.067 6和m/z 203.146 0，且上述兩碎片離子的產生方式如圖1所示。同時，其它碎片離子還包括m/z 185.135 5，157.103 0，119.083 3和215.144 9等，且全部碎片情況均與將斑蝥黃的化學結構式導入MassLynx并按偏差3 mDa和最可能斷鍵方式等條件篩選后輸出的結果相對一致，具體信息見表2。

圖1 斑蝥黃QTOF質譜圖

表2 斑蝥黃碎片信息表

2.2 標準曲線及譜圖

斑蝥黃在UPLC-QTOF條件下峰形良好，保留時間為2.69 min，見圖2。在0.1～200 ng/mL濃度范圍內線性良好，線性方程為Y=6 244.3X-4 779.3，R2=0.999 4，見圖3。

圖2 斑蝥黃標準溶液UPLC-QTOF譜圖（100 ng/mL，RT 2.69 min）

圖3 QTOF條件下斑蝥黃標準曲線

2.3 樣品測定

樣品預處理及UPLC-MS/MS條件參考SN/T 2327—2009。選取4種蛋黃顏色不同的雞蛋樣品，利用UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS對生雞蛋（F）和熟雞蛋（C）試樣進行同步分析，相關結果見表3。

試驗結果表明，所有樣液的譜圖中均具有分離度較高且保留時間與斑蝥黃標準物質偏差在±5%以內的目標峰，且目標峰的碎片離子精確質荷比及其豐度與斑蝥黃標準物質基本一致，定性結果與標準方法[14]完全相同，說明該方法適用于定性檢測雞蛋中的斑蝥黃，且該方法的測定低限也與標準方法[14]（0.1 mg/kg）相同。同時，在定量方面，除斑蝥黃含量低于0.01 mg/kg的試樣外，UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS分析試樣時的相對偏差在2.7%～5.5%之間；當斑蝥黃含量低于0.01 mg/kg時，對應的樣品溶液質量濃度接近0.1 ng/mL最低定量濃度，相對偏差在1.4%～19.4%之間；但兩種方法的檢測結果均相對一致，且均能相對準確地反映雞蛋中斑蝥黃的含量水平，在一定程度上說明該方法可以作為雞蛋中斑蝥黃質量控制的有效輔助手段。

表3 UPLC-QTOF和UPLC-MS/MS的測試結果

3 結論

利用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UPLC-QTOF）技術，建立了一種斑蝥黃的定性檢測方法。該方法具有較高的靈敏度，與標準方法相當。相比于UPLC-MS/MS，QTOF可實現精確化合物質荷比至小數點后4位且質量精度仍小于10-6，具有極高的可靠性和穩定性，并可以同時識別更多碎片離子，便于更準確的定性研究。此次試驗為雞蛋中斑蝥黃的檢測提供了一種高分辨率的檢測技術，對于蛋品的市場監管具有重要意義。