基于網絡藥理學探討半夏瀉心湯治療糖尿病胃輕癱胃排空延遲的作用機制

徐婷婷 崔國良 馮小可 謝立群

摘要：目的? 基于網絡藥理學方法分析半夏瀉心湯的關鍵活性成分治療糖尿病胃輕癱（DGP）胃排空延遲的作用機制。方法? 利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP）獲取半夏瀉心湯的主要活性成分及其對應的作用靶點，在人類基因數據庫（GeneCards）中搜索DGP胃排空延遲相關的靶點，利用Cytoscape3.7.1軟件構建中藥活性成分-靶點網絡，運用STRING數據庫構建蛋白相互作用（PPI）網絡，利用DAVID6.8在線工具進行靶點的GO功能富集和KEGG通路富集分析。結果? 篩選出半夏瀉心湯復方中的152個活性成分，作用于108個靶點，其中關鍵靶點21個，包括AKT1、ESR1和STAT3等。GO功能分析共獲得392條富集結果，其中，生物過程主要涉及對藥物的反應，對凋亡、蛋白磷酸化和基因表達的調控等299條;分子功能涉及酶結合、蛋白結合、細胞因子活性等37條;細胞組分涉及細胞質、細胞外區域、線粒體和細胞核等56條。KEGG分析結果顯示，TNF、HIF-1和PI3K-Akt等信號通路與半夏瀉心湯治療DGP胃排空延遲密切相關。結論? 本研究初步揭示半夏瀉心湯治療DGP胃排空延遲是多成分、多靶點和整體調節的復雜過程，為后續研究提供新的理論依據。

關鍵詞：網絡藥理學;半夏瀉心湯;糖尿病胃輕癱;信號通路;靶點

中圖分類號：R259;R285??? 文獻標識碼：A??? 文章編號：2095-5707（2020）05-0007-07

DOI： 10.3969/j.issn.2095-5707.2020.05.002

Abstract： Objective To explore the core active components and targets of Banxia Xiexin Decoction and the possible mechanism of treating delayed gastric emptying in diabetic gastroparesis based on network pharmacology. Methods Major active components and corresponding target genes of Banxia Xiexin Decoction were obtained by Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology （TCMSP）， and the target genes of diabetic gastroparesis were obtained by GeneCards. Cytoscape3.7.1 software was used to construct the active components-target network of TCM. The network of protein interaction （PPI） was constructed by using STRING database. The DAVID6.8 online tool was used for the gene ontology （GO） analysis and kyoto encyctopedia of genes and genomes （KEGG） pathway enrichment analysis of target genes. Results Totally 152 activecomponents of Banxia Xiexin Decoction were selected， which acted on 108 targets， 21 of which were key targets， involving AKT1， ESR1 and STAT3. GO functional analysis obtained a total of 392 enrichment results. Among them， the biological process mainly involved 299 items such as response to drugs， regulation of apoptosis， protein phosphorylation and gene expression， etc.; molecular functions involved 37 items such as enzyme binding， protein binding， and cytokine activity; cell components involved 56 items including cytoplasm， extracellular area， mitochondria and nucleus. KEGG results showed that signal pathways such as TNF， HIF-1 and PI3K-Akt were closely related to delayed gastric emptying in diabetic gastroparesis treated by Banxia Xiexin Decoction. Conclusion This study preliminarily reveals that Banxia Xiexin Decoction for delayed gastric emptying in diabetic gastroparesis is a complex process with multiple components， multiple targets and overall regulation， which provides a new theoretical basis for the follow-up studies.

Key words： network pharmacology; Banxia Xiexin Decoction; diabetic gastroparesis; signaling pathways; targets

糖尿病（Diabetes Mellitus，DM）是一種嚴重危害人類健康的代謝性疾病。資料顯示，5年以上糖尿病病史的患者中約有50%的患者會伴發糖尿病胃輕癱（Diabetic Gastroparesis，DGP）[1]。DGP屬于一種糖尿病胃腸植物神經病變，主要以胃排空延遲為特點，表現為早飽、腹脹、惡心、嘔吐、上腹痛和體重減輕等，嚴重影響患者對食物和藥物的消化吸收，加重糖代謝異常，使患者的生活質量明顯下降，加重家庭的經濟負擔。因此，對于DGP的治療至關重要。

西醫治療DGP的主要方法包括控制血糖、使用促胃腸動力藥物，如新型選擇性5-羥色胺（5-HT）4受體激動劑及多巴胺D2受體阻滯劑，及維持水電解質平衡等。但由于對DGP發病機制的認識尚不明確，目前臨床上尚無其他有效治療手段，且促胃腸動力藥物存在QT間期延長、增加心腦血管不良事件或錐體外系反應等副作用，故需要探索新的治療途徑。近年來中醫治療DGP療效顯著，其中出自張仲景《傷寒論》的半夏瀉心湯是臨床治療DGP的常用方劑之一。半夏瀉心湯由半夏、黃芩、干姜、人參、黃連、大棗、炙甘草7味藥物組成，具有調和肝脾、寒熱平調、消痞散結之功。研究表明，半夏瀉心湯能明顯改善DGP患者的臨床癥狀[2-3]，其主要機制包括：增加胃竇Cajal間質細胞（Interstitial Cells of Cajal，ICC）數量[4]，改善腸道菌群比例、抑制炎癥因子的釋放[5]，調節胃腸激素、降低血糖及改善胰島素抵抗[6]等。目前對于半夏瀉心湯改善DGP的主要活性成分、作用靶點及相關信號通路尚不明確，而網絡藥理學基于“藥物-靶點-疾病”相互作用網絡，能整體和系統研究中藥的復雜成分及其相互作用，為中醫藥研究提供新思路。故本研究采用網絡藥理學研究方法，對半夏瀉心湯治療DGP的作用機制進行探討，為后期實驗提供研究方向和理論依據。

1? 資料與方法

1.1? 半夏瀉心湯活性成分及靶點篩選

利用中藥系統藥理學數據庫和分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）獲得各中藥的活性成分及其作用靶點。根據口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18，篩選出半夏瀉心湯的活性成分及其對應的靶點。利用Uniprot數據庫（https：//www.uniprot.org）和美國國家生物技術信息中心數據庫（NCBI，https：//www.ncbi. nlm. nih.gov），限定物種為人，將靶點轉換為相應的基因名稱。

1.2? DGP相關靶點篩選

在GeneCards數據庫（https：//www.genecards. org）中，以“diabetic gastroparesis”和“delayed gastric emptying”為關鍵詞，以關聯系數≥5作為篩選標準，獲得DGP疾病相關靶點。

1.3? 半夏瀉心湯治療DGP潛在靶點預測

將半夏瀉心湯活性成分對應的靶點與DGP相關靶點取交集，交集靶點可能是半夏瀉心湯治療DGP的潛在作用靶點。使用Cytoscape3.7.1軟件構建中藥活性成分-靶點網絡。

1.4? 蛋白相互作用網絡構建

將“1.3”中篩選出的交集靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org），限定研究物種為“homo sapiens”，最低相互作用評分設置為最高置信度0.90，其余設置為默認值，將數據導入Cytoscape3.7.1軟件，構建半夏瀉心湯治療DGP的蛋白相互作用（PPI）網絡圖。

1.5? GO功能富集和KEGG通路富集分析

在DAVID6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov）中輸入“1.3”中篩選出的交集靶點，選擇物種為“homo sapiens”，設定閾值P<0.01，進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，并將富集分析結果進行可視化處理。

2? 結果

2.1? 半夏瀉心湯主要活性成分及其靶點

在TCMSP數據庫中收集半夏瀉心湯活性成分，根據OB≥30%和DL≥0.18的條件篩選后，得到半夏13個、大棗29個、甘草85個、干姜5個、黃連14個、黃芩36個、人參22個，去除重復后，共獲得162個活性成分，對應靶點273個。

2.2? DGP相關靶點及半夏瀉心湯活性成分-靶點網絡

從GeneCards數據庫中檢索到DGP相關靶點532個。將其與活性成分對應的靶點取交集后，得到半夏瀉心湯治療DGP的預測靶點108個，對應152個活性成分。利用Cytoscape3.7.1軟件構建半夏瀉心湯活性成分-靶點網絡（見圖1）。該網絡中有260個節點，其中活性成分節點152個、靶點基因節點108個，成分與靶點之間存在1192條相互作用連線。從圖1可以看出，MOL000098（槲皮素）潛在靶點最多，為77個，其次分別為MOL000173（漢黃芩素）34個、MOL000422（山柰酚）25個。此外在網絡中，前列腺素G/H合成酶（Prostaglandin G/H Synthase，PTGS）2靶點對應活性成分數目最多，為134個;其次為熱休克蛋白（Heat Shock Protein，HSP）90AA1和雌激素受體（Estrogen Receptor，ESR）1，分別有103和89個對應活性成分。該網絡中約91.4%的活性成分至少與2個靶點相互作用，而64.2%的靶點同時接受≥2個活性成分的調控，說明半夏瀉心湯中的活性成分可能作用于整個網絡系統中，不同的靶點可以接受1個或者多個活性成分的調控，形象地反映出中藥作用的整體性和復雜性，體現中藥“多成分-多靶點-多途徑”的綜合調節作用。

2.3? 半夏瀉心湯治療DGP蛋白相互作用網絡

將108個預測靶點導入STRING數據庫進行PPI網絡分析，PPI網絡圖見圖2。網絡中發生相互作用的靶點有103個，共有926條邊，節點顏色越深，與其相連的邊越多，度值越大。網絡中各節點的平均度值為9.06，平均介數為0.016，平均中心度數為0.436。度、中心度數、介數均超過平均值的靶點有21個，詳情見表1。

2.4? GO功能富集和KEGG通路富集分析

以P<0.01為篩選條件，在DAVID6.8數據庫獲得392條GO功能富集分析結果。其中，生物過程相關條目299條，主要涉及對藥物的反應，對凋亡過程的負調節，對RNA酶Ⅱ啟動子轉錄、蛋白磷酸化和基因表達的正向調控等方面;分子功能相關條目37條，主要涉及酶結合、蛋白結合、蛋白同源二聚化活性、細胞因子活性和蛋白異源二聚化活性等方面;細胞組分相關條目56條，主要涉及細胞質、細胞外區域、線粒體和細胞核等方面。GO功能富集結果中-log10 P值居前20位的條目見圖3。

KEGG通路富集結果顯示，108個靶點顯著富集在121條通路上（P<0.01），有48條通路與DGP密切相關，前10條信號通路包括TNF信號通路、HIF-1信號通路、FoxO信號通路、PI3K-Akt信號通路、T細胞受體（T cell receptor，TCR）信號通路、Toll樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號通路、Prolactin信號通路、P53信號通路、NOD-like receptor信號通路、ErbB信號通路，提示半夏瀉心湯可能通過以上多條信號通路治療DGP。KEGG通路富集顯著性（P值）最強的20條通路見圖4。

3? 討論

祖國醫學認為糖尿病胃輕癱屬“消渴”合并“痞滿”“嘔吐”“胃痛”等范疇，其病位在脾胃，多因消渴日久，耗傷氣陰，氣損血瘀，脾胃升降失和，納運失權，以致痞滿不舒，濕熱內蘊，寒熱互結于心下。半夏瀉心湯全方寒熱互用以和陰陽，苦辛并進以調其升降，補瀉兼施以顧其虛實，具有清熱除痞、健運脾胃之功。

本次研究獲得半夏瀉心湯治療DGP對應活性成分152個，其中具有潛在靶點較多的是槲皮素、漢黃芩素和山柰酚，都是天然黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化和降糖等作用[7]。糖尿病患者處于高氧化應激狀態，正常的抗氧化調節機制受損，導致ICC數量減少、超微結構異常，進而加重胃排空延遲。同時高血糖會抑制神經元，誘導細胞氧化損傷，從而影響激素水平[8]。另外，炎癥也是加重DGP患者胃排空延遲的重要原因之一，其中TNF-α、 IL-6、IL-10起著至關重要的作用[9]。現代藥理研究發現，槲皮素能直接消除活性氧（ROS）自由基，起到抗氧化作用，改善胰島素抵抗和增強胰島素的敏感性[10-11]，降低炎癥因子分泌[12]。山柰酚能通過抗氧化，抑制醛糖還原酶減輕2型糖尿病大鼠的并發癥[13];同時降低血糖，改善胰島素敏感性和糖脂代謝紊亂[14]，并調節促炎酶的活性和炎癥相關基因的表達[15]。漢黃芩素能消除ROS自由基，抑制多種酶類活性和脂質氧化過程[16]。故綜合此次分析預測及相關研究結果，推測半夏瀉心湯治療DGP胃排空延遲的作用機制可能為通過抗氧化應激、調節胰島素敏感性和抗炎等途徑改善糖尿病患者狀態，恢復胃平滑肌的正常生理功能。

通過對靶點的進一步分析發現，PTGS2、HSP90AA1和ESR1與DGP的發生、發展有著密切的關系。其中PTGS也稱環氧化酶（COX），是花生四烯酸合成前列腺素過程中的關鍵酶，催化合成的前列腺素可以保護胃腸道并調節胃腸運動。研究發現，下調COX-2能減輕炎癥反應且COX-2抑制劑能明顯改善DGP大鼠的胃排空延遲[17-18]。HSP90在多種應激狀態下誘導產生，是真核細胞參與細胞保護作用的重要蛋白之一。有研究發現，DGP患者胃組織存在微血管病變，微血管管壁迂曲厚薄不一，甚至連續性中斷[19]，而HSP90能誘導一氧化氮合酶（NOS）合成一氧化氮（NO）[20]，從而發揮保護血管內皮和擴張血管的功能，并能抑制血小板聚集粘附和平滑肌細胞增殖，在糖尿病微血管病變中起到關鍵作用[21]。ESR1編碼的雌激素受體（ER）α既能調控雌激素的水平，也是激活配體的轉錄因子。糖尿病患者中超80%為女性，有明顯的性別差異[22]。相關研究表明，女性糖尿病患者發生胃輕癱時伴有體內雌激素水平降低及胃NO新號通路受損[23]。另有研究表明，DGP大鼠幽門部ER水平上調，雌激素能通過抗氧化應激保護自主神經、維持NO信號通路，從而改善DGP引起的胃排空延遲[24]。綜合以上分析預測結果及相關研究結果，推測半夏瀉心湯可能通過作用于多個靶點來抑制COX-2、促進NO合成和調控雌激素水平，從而促進胃排空，改善DGP患者消化系統癥狀。

GO功能富集分析發現，半夏瀉心湯治療DGP主要體現在對藥物的反應，對凋亡、蛋白磷酸化和基因表達等過程的調節，涉及酶結合、蛋白結合和細胞因子活性等方面，主要對細胞質、細胞外區域、線粒體和細胞核等細胞組分起作用。研究發現，DGP患者胃竇平滑肌細胞出現細胞縮小、胞核不規則、線粒體腫脹、縫隙連接破壞和膜外基層增厚等病理改變[25]，經半夏瀉心湯治療后能改善這種胃平滑肌受損的超微結構，恢復其原有功能[26]，這與GO分析預測結果一致。

KEGG通路富集分析發現，48條通路與DGP發病密切相關。其中TNF和NF-κB信號通路是經典的炎癥相關通路，動物實驗顯示，半夏瀉心湯能抑制TNF和NF-κB信號通路的激活，顯著降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8的表達和升高抑炎因子IL-10的表達，改善DGP大鼠胃動力障礙[27]。半夏瀉心湯的主要活性成分之一——槲皮素可減弱TNF-α對骨骼肌細胞的損傷，并通過Akt和MAPK等通路使骨骼肌細胞增加對葡萄糖的攝取及增強胰島素敏感性，從而改善2型糖尿病并發癥[28]。槲皮素和山柰酚能通過抑制NF-κB信號通路降低誘導型一氧化氮合酶（iNOS）、C-反應蛋白（CRP）、COX-2蛋白和基因的表達，從而起到抗炎作用[29]。PI3K-Akt信號通路是胰島素信號傳導途徑之一，可調控葡萄糖穩態和脂質代謝[30]，漢黃芩素通過PI3K-Akt信號通路促進胰島素分泌和骨骼肌對葡萄糖的攝取與利用，從而降低血糖[31]。TLR信號通路在高脂高糖條件下激活后會促進炎癥因子的表達和加重胰島素抵抗[32]，槲皮素可通過上調TLR的負調節因子Tollip的表達來抑制由脂多糖誘導的細胞表面分子CD80、CD86等的表達和促炎因子TNF-α、IL-1β、IL-6的產生[33]。綜合以上分析預測結果及相關研究結果，推測半夏瀉心湯能通過作用于多個信號通路來發揮作用，其具體相關機制有待實驗的進一步驗證。

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（收稿日期：2020-07-08）

（修回日期：2020-07-24;編輯：鄭宏）