貴州地方白羽雞種MSTN基因SNP位點快速篩查及其蛋白功能預測

龍廣麗　牟騰慧　劉洋　饒永超　楊德鳳　譚光輝　林家棟　傅筑蔭　張福平

摘要：【目的】明確貴州地方白羽雞種肌肉生長抑制素（MSTN）基因的多態性，篩選出改良白羽雞肉質品質的分子遺傳標記，為選擇培育優良肉質雞種提供參考依據。【方法】以興義矮腳雞白羽品系、羅曼蛋雞及興義矮腳雞白羽品系與羅曼蛋雞雜交的自交后代（F2）為研究對象，提取3個雞種的血液基因組DNA構建DNA混合池，PCR擴增MSTN基因全部外顯子序列，直接測序篩選SNP位點并進行生物信息學分析，探究SNP位點突變對MSTN基因mRNA二級結構及編碼蛋白結構和功能的影響。【結果】在雞MSTN基因第1外顯子（Exon-1）篩查到6個SNPs位點，分別為G51A、A60G、G195C、A234G、C297T和C324T，且6個SNPs位點均為同義突變。在A234G位點處檢測到興義矮腳雞白羽系和F2代存在多態性，但羅曼蛋雞未發生變異;在C297T位點處檢測到羅曼蛋雞存在多態性，以C為優勢等位基因，而興義矮腳雞白羽品系和F2代均未發生變異;G51A、G60A、G159C和C324T等4個SNPs位點在3個雞種中均存在多態性。A234G位點突變對雞MSTN基因mRNA二級結構穩定性無影響，G51A位點突變致使MSTN基因mRNA二級結構最小自由能降低但未改變其構象，A60G、G195C、C297T和C324T等4個SNPs位點突變均引起MSTN基因mRNA二級結構和最小自由能的改變。雞MSTN基因編碼蛋白為不穩定的脂溶性蛋白，存在信號肽，但不存在跨膜區域，其二級結構由無規則卷曲、β-折疊和α-螺旋組成，且以無規則卷曲占比最高。【結論】MSTN基因在貴州地方白羽雞種中的多態性較豐富，其中A60G、G195C、C297T和C324T等4個SNPs位點突變會導致基因mRNA二級結構的構象發生改變，可作為改良白羽雞肉質品質的分子遺傳標記進一步研究。

關鍵詞： 貴州地方白羽雞種;MSTN基因;肉質性狀;SNP位點;多態性;生物信息學

中圖分類號： S831.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1840-09

Rapid screening and protein function prediction of MSTN gene SNP sites in Guizhou local chicken breeds

LONG Guang-li1，2，3， MOU Teng-hui1，2，3， LIU Yang1，2，3， RAO Yong-chao1，2，3，

YANG De-feng1，2，3， TAN Guang-hui1，2， LIN Jia-dong1，2， FU Zhu-yin2，3，

ZHANG Fu-ping1，2，3*

（1College of Animal Science， Guizhou University/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in the Plateau Mountainous Region， Ministry of Education/Key Laboratory of Animal Genetics， Breeding and Reproduction in Guizhou， Guiyang? 550025， China; 2Institute of Poultry， Guizhou University， Guiyang? 550025， China;

3Scientific Research Chicken Farm of Guizhou University， Guiyang? 550025， China）

Abstract：【Objective】To identify the polymorphism of the myostatin （MSTN） gene of Guizhou local white feather chicken breeds， screen out ideal molecular genetic markers which could improve the meat quality of white feather chi-ckens， and provide a reference for selecting and breeding excellent broiler chicken breeds. 【Method】Taking Xingyi bantam white feather line， Roman laying chicken and self-progeny（F2） of cross between Xingyi bantam white feather line and Roman laying chicken as the research object， the blood genomic DNA of three chicken breeds was extracted to construct a DNA mixing pool. The PCR amplification of all exon sequences of MSTN gene was directly sequenced and screened. Then the SNP sites were bioinformatically analyzed to explore the impact of SNP site mutations on the se-condary structure of MSTN gene mRNA and the structure and function of the encoded protein. 【Result】Six SNPs sites were screened in the first exon（Exon-1） of the chicken MSTN gene， which were G51A， A60G， G195C， A234G， C297T and C324T， and the six SNPs sites were all synonymous mutations. At the A234G locus， polymorphisms were detected in the Xingyi bantam white feather line and F2 generation， but no mutations occurred in the Roman laying chickens; polymorphisms were detected in the Roman laying chickens at the C297T locus， with C as the dominant position. There were no mutations in Xingyi bantam white feather line and F2 generation. At four SNPs， including G51A， G60A， G159C and C324T， polymorphisms were all detected in three chicken breeds. A234G site mutation had no effect on the stability of the secondary structure of chicken MSTN gene mRNA. G51A site mutation reduced the minimum free energy of mRNA secon-dary structure but did not change its conformation. Four SNPs site mutations including A60G， G195C， C297T and C324T caused changes in the secondary structure and minimum free energy of MSTN gene mRNA. The chicken MSTN gene encoding protein was an unstable fat-soluble protein with a signal peptide but no transmembrane regions. Its secondary structure consisted of random coils， β-fold and α-helixes， with random coils accounting for the highest proportion. 【Conclusion】The MSTN gene has abundant polymorphisms in Guizhou local white feather chicken breeds. Among them， four SNPs mutations such as A60G， G195C， C297T and C324T cause changes in the conformation of the gene mRNA secondary structure， which can be used to do further studies as molecular genetic markers improving the quality of white feather chicken.

Key words： Guizhou local white feather chicken breeds; MSTN gene; meat quality traits; SNP site; polymorphism; bioinformatics

Foundation item： Guizhou Science and Technology Planning Project（QKHZC〔2016〕2507）

0 引言

【研究意義】興義矮腳雞白羽系主產于貴州黔西南州興義市，其脛短身矮、體軀勻稱、全身羽毛白色，為隱性白羽雞，在生產性能和肉質方面具有許多優良特性，但產蛋性能不高（朱麗莉等，2011;李林洪，2019）。羅曼蛋雞的產蛋率高，蛋品質優良（劉雅正，2014），但至今針對其肉質方面的相關研究甚少。優勢雜交可顯著提高畜禽的生產性能和經濟效益（王芬和王鵬，2009），目前國內隱性白羽雞在雜交育種中主要用作母本（李俊英，2005）。選用興義矮腳雞白羽系作為配套母本與羅曼蛋雞雜交，其后代具有較高的生產性能，但在生產性能改良過程中興義矮腳雞白羽系雜交后代的體型發生明顯變化，因此，亟待篩選出白羽雞肉質品質的理想分子遺傳標記，在不改變地方雞種優質性能的前提下有效提高白羽雞的產肉性能。【前人研究進展】肌肉生長抑制素（Myostatin，MSTN）又稱為生長分化因子8（Growth differentiation factor-8，GDF-8），可抑制成肌細胞的活化、增殖和分化（McFarland et al.，2007）。MSTN基因是轉化生長因子β（TGF-β）超家族成員之一，其特異性表達于畜禽肌肉組織中（McPherron et al.，1997）。MSTN基因作為胞外信號分子能與成肌細胞膜上的受體結合而引起受體自身磷酸化，啟動細胞內一系列信號傳導途徑，作用于生肌決定因子靶基因的調控區，調節肌肉組成蛋白基因表達，進而對骨骼肌的生長發育起負調控作用（Lee，2004;Grade et al.，2009;趙義龍等，2017）。MSTN基因突變或缺失可使家畜表現出肌肉超級發達的雙肌性狀（鄭云，2007;楊永生等，2012;趙振華等，2015），在負向調控肌細胞的過程中若MSTN活性喪失或減弱，則無法正常調節肌纖維沉積，導致動物肌肉過度發育（Grobet et al.，1997;Bellinge et al.，2005;張賢嫻等，2018）。近年來的相關研究顯示，MSTN基因作為畜禽生長發育及肉用性狀相關的候選基因，其在胚胎發育過程中的免疫中和作用可促進肌肉生長（Kim et al.，2006），同時參與脂肪代謝過程，抑制脂肪形成（Guo et al.，2008），進而調節動物肌肉與脂肪的比例，在改善畜禽肉質方面具有極高的研究價值（曹婷等，2017）。Fontanesi等（2011）研究發現家兔MSTN基因SNP位點突變與其肝臟和胴體量相關;Xu等（2013）研究表明北京鴨MSTN基因多態性與其胸肌肌肉厚度顯著相關;Zhang等（2015）研究發現，MSTN基因c.234G>A突變位點可作為輔助育種分子標記，以提高雞的繁殖效率;Mitrofanova等（2017）在分析雞MSTN基因SNP多態性時發現，AA基因型個體的活重明顯高于其他基因型個體。可見，MSTN基因是繁育優良肉質雞種的一個重要候選基因。【本研究切入點】雞MSTN基因全長5493 bp，包含3個外顯子（劉雪穎，2008），但至今有關白羽雞MSTN基因多態性及其蛋白結構的研究鮮見報道。【擬解決的關鍵問題】以興義矮腳雞白羽品系、羅曼蛋雞及興義矮腳雞白羽品系與羅曼蛋雞雜交的自交后代（F2）為研究對象，構建DNA混合池，PCR擴增MSTN基因全部外顯子序列，直接測序篩選SNP位點并進行生物信息學分析，明確SNP位點突變對MSTN基因mRNA二級結構及編碼蛋白結構和功能的影響，旨在篩選出改良白羽雞肉質性狀的分子遺傳標記，為選擇培育優良肉質雞種提供參考依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

興義矮腳雞白羽品系（B）、羅曼蛋雞（L）及F2代各60份血液樣品，均采自貴州大學科研雞場，所有血液樣品均置于肝素鈉抗凝真空采血管中，-20 ℃保存備用。血液基因組DNA提取試劑盒、GoldView核酸染料、DL2000 DNA Marker和2×Taq Master Mix均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;TBE緩沖液、雙蒸水和瓊脂糖等試劑購自上海鼎國生物技術有限公司。

1. 2 基因組DNA提取

利用血液基因組DNA提取試劑盒提取血液樣品基因組DNA，以1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取效果，用紫外分光光度計測量各DNA樣品濃度，測量3次取平均值，并將所有DNA樣品濃度調至100 ng/μL，各取10.0 μL構建不同雞種的DNA混合池。

1. 3 引物設計及PCR擴增

根據GenBank已公布的雞MSTN基因序列（登錄號NC_006094.5），運用Primer Premier 5.0設計引物（表1），并委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應體系25.0 μL：2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各1.0 μL，DNA模板1.0 μL，雙蒸水9.5 μL。擴增程序：94 ℃預變性3 min;94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，進行35個循環;72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。PCR擴增產物用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

1. 4 序列校對及等位基因頻率估算

利用DNASTAR中的MegAlign和EditSeq程序結合測序峰圖，拼接得到白羽雞種MSTN基因編碼區（CDS）序列，然后與GenBank已公布的雞MSTN基因CDS序列進行比對，鑒定篩選出SNP位點。運用SeqMan分析測序峰圖，采用MWSnap v3.00.74中的標尺測量各SNP位點等位基因的相應峰高，并按照崔建勛等（2005）、祖盤玉等（2019）的方法估算等位基因頻率。

f_i=h_i/（h₁+h₂）

式中，fi表示SNP位點某等位基因頻率，h1和h2分別表示測序峰圖某等位基因1峰和2峰的高度。

1. 5 生物信息學分析

參照翁吉梅等（2018）的研究方法對3個雞種的MSTN基因進行生物信息學分析。采用RNAfold和RNA structure預測不同SNP位點及其突變前后對MSTN基因mRNA二級結構的影響，并以PredictProtein預測SNP位點突變前后的MSTN蛋白二級結構。

2 結果與分析

2. 1 PCR擴增結果

PCR擴增得到雞MSTN基因的全部外顯子序列（Exon-1、Exon-2和Exon-3），經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示，電泳條帶單一、明亮清晰，無拖帶等現象，說明擴增效果良好，且片段大小與預期結果相符。圖1為雞MSTN基因Exon-1的PCR擴增電泳檢測結果。

2. 2 測序分析結果

以雞MSTN基因（登錄號NC_006094.5）為參考序列，采用DNA混合池（每個品種60份血液樣品，各取1.0 μL）結合PCR直接測序法對雞MSTN基因外顯子序列上的SNP位點進行鑒定，再運用DNASTAR等在線軟件對所得序列進行比對分析，結果在雞MSTN基因Exon-1上篩查到6個SNPs位點（圖2），分別是G51A、A60G、G195C、A234G、C297T和C324T，且6個SNPs位點均為同義突變。

2. 3 等位基因頻率估算結果

利用MWSnap v3.00.74中的標尺測量不同雞種MSTN基因6個SNPs位點的等位基因峰值，并估算等位基因頻率，結果（表2）顯示，在A234G位點處檢測到興義矮腳雞白羽系和F2代存在多態性，但羅曼蛋雞未發生變異;在G159C位點處檢測到羅曼蛋雞的G和C基因頻率差異不明顯，而在興義矮腳雞白羽系和F2代均以G為優勢等位基因;在C297T位點處檢測到羅曼蛋雞存在多態性，以C為優勢等位基因，而興義矮腳雞白羽品系和F2代均未發生變異。G51A、A60G、G159C和C324T等4個SNPs位點在3個雞種中均存在多態性。

2. 4 生物信息學分析結果

2. 4. 1 mRNA二級結構預測分析結果 采用RNAfold預測不同雞種MSTN基因SNP位點突變前后各基因型的mRNA二級結構，結果如圖3所示。A234G位點突變未引起MSTN基因mRNA二級結構構象及最小自由能的改變，即對其穩定性無影響;A60G、G195C和C297T位點突變致使MSTN基因mRNA二級結構的最小自由能分別增加至-282.90、 -281.90和-281.20 kcal/mol，結構穩定性降低;而G51A和C324T位點突變致使MSTN基因mRNA二級結構的最小自由能分別降低為-284.30和-286.10 kcal/mol，結構穩定性增強。此外，A60G、G195C、C297T和C324T位點突變會導致MSTN基因mRNA二級結構的構象發生改變，但G51A和A234G位點突變未改變MSTN基因mRNA二級結構的構象。

2. 4. 2 MSTN蛋白理化性質預測分析結果 ProtParam預測分析結果表明，雞MSTN蛋白由375個氨基酸殘基構成，其相對分子量為42707.04 Da，總原子數為5983，分子式為C1903H2986N510O562S22，理論等電點（pI）為6.93，正、負電荷氨基酸殘基均有46個。在含有的常見20種氨基酸中，所占比例最高的是亮氨酸（Leu），占總氨基酸的8.0%;所占比例最低的是組氨酸（His），占1.3%;無吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。雞MSTN蛋白不穩定系數為43.68，屬于不穩定性蛋白;其平均親水性為（-0.392），屬于脂溶性蛋白。

2. 4. 3 信號肽預測分析結果 采用SignalP 4.0對雞MSTN蛋白信號肽進行預測，結果（圖4）表明，C分值為0.124，Y分值為0.260，S分值為0.560（若S分值平均值高于0.500，則為分泌蛋白，且存在信號肽），說明雞MSTN蛋白存在信號肽，屬于分泌蛋白。

2. 4. 4 MSTN蛋白跨膜結構預測結果 以TMHMM 2.0預測分析雞MSTN蛋白跨膜結構，結果發現組成MSTN蛋白的375個氨基酸殘基均在膜外（圖5），不存在跨膜區域。

2. 4. 5 MSTN蛋白亞細胞定位分析結果 PSORT II Prediction的蛋白亞細胞定位結果表明，雞MSTN蛋白在細胞質（47.8%）、細胞核（21.7%）、細胞膜（13.0%）和細胞骨架（4.3%）中發揮生物學作用。

2. 4. 6 MSTN蛋白二級結構分析結果 SOPMA預測結果表明，在雞MSTN蛋白二級結構中所占比例最高的是無規則卷曲（圖6），屬于混合型蛋白。其中，α-螺旋主要形成于第2～18、40～42、46～63、74～79、86～96、111～112、209～217、290～293和327～328位氨基酸殘基;β-折疊在第115～120、136～141、150～153、155～160、169～179、187～195、203～207、225～231、238～240、252～257、280～289、296～299、304～305、307～311、325～326、343～345、349～353、359～364和368～371位氨基酸殘基處分布較多;無規則卷曲則在第1～2、19～39、43～45、64～73、80～85、97～110、113～114、121～135、142～149、154、161～168、180～186、196～202、208、218～224、232～237、241～251、258～279、294～295、300～303、306、312～324、329～342、346～348、354～358、365～367和372～375位氨基酸殘基處分布較多。

3 討論

在雞的肌肉發生、生長和發育過程中，MSTN基因發揮著重要作用，其CDS序列具有豐富多態性，對雞的生長性狀有顯著影響（Dushyanth et al.，2016）。張冉和林浴霜（2012）研究發現，在雞胚發育過程中不同雞品種及不同發育階段的MSTN基因表達量存在明顯差異，說明MSTN對不同雞品種肌肉發育的調節能力存在差異，而導致肌纖維數量及肌肉含量不同。左斌等（2015）研究表明，MSTN基因主要影響雞的生長性狀，可作為地方雞品種選育的候選基因。王彥欽和邵勇鋼（2017）研究發現，MSTN基因多態性與拜城油雞體重、屠體重、半凈膛重、全凈膛重、胸肌重和腿肌重等生產性能指標密切相關，故推測該基因可作為拜城油雞選育的分子遺傳標記。此外，有研究發現MSTN基因多態性對12周齡雞屠宰及肉質性能的各項指標均有影響，說明MSTN基因不僅在骨骼肌的生長發育過程中發揮作用，還可能參與脂質代謝和脂肪沉積（顧志良等，2003）。MSTN基因是提高畜禽肌肉產量和改善肉品質研究的首選基因（王巧巧等，2018），作為肌肉發育的負向調控因子，可通過影響MyoD、Myogenin和Myf5等基因控制肌細胞從G1期到G2期及G2期到M期的轉變，進而影響肌肉的發育過程（Feldman et al.，2006）。李維等（2017）研究發現，MSTN基因對赤水烏骨雞肉質指標中的pH和剪切力具有明顯影響，推測該基因參與調控赤水烏骨雞肉質性狀。可見，MSTN基因是影響雞肉質性狀的主效基因之一，探究MSTN基因SNP位點突變對基因表達的影響，對提高白羽雞的養殖效益具有重要意義。

本研究在雞MSTN基因Exon-1上發現G51A、A60G、G195C、A234G、C297T和C324T等6個SNPs位點，均為同義突變，未改變編碼氨基酸序列，由于密碼子的簡并性，同義密碼子的使用頻率存在差異，但對MSTN基因表達是否產生影響還有待進一步探究。此外，在G159C位點檢測到羅曼蛋雞的G和C基因頻率差異不明顯，而在興義矮腳雞白羽系和F2代中均以G為優勢等位基因，說明羅曼蛋雞與其他2個雞種在該位點處存在明顯差異。在MSTN基因Exon-2和Exon-3上未發現SNP位點，與毛亮等（2009）對藏雞MSTN基因、溫彥濤等（2012）對優質雞S3系MSTN基因的多態性檢測結果相似，但與張麗等（2018）對靜寧雞MSTN基因進行SNP位點篩查的結果相比，G51A、C297T和C324T是新發現的SNP位點，可能是相對于Exon-1，Exon-2和Exon-3更加保守所致。雞MSTN蛋白理化性質預測結果顯示，亮氨酸的占比最高，組氨酸的占比最低，且未發現吡咯賴氨酸和硒半胱氨酸;其不穩定系數為43.68，即MSTN蛋白屬于不穩定性蛋白，與任衛合等（2018）的研究結果相似。

CDS序列上的核苷酸突變可能引起基因mRNA二級結構及其編碼蛋白結構改變，進而影響其生物學功能（李倩，2013）。采用RNAfold對雞MSTN基因mRNA二級結構的預測結果顯示，A234G位點突變未引起MSTN基因mRNA二級結構改變;A60G、G195C和C297T位點突變導致MSTN基因mRNA二級結構的最小自由能增加，mRNA二級結構穩定性降低;G51A和C324T位點突變則致使MSTN基因mRNA二級結構的最小自由能降低，mRNA二級結構穩定性增強。此外，雞MSTN蛋白二級結構中以無規則卷曲結構數量最多，屬于混合型蛋白，與任衛合等（2018）、張麗等（2018）的研究結果相似，即均以無規則卷曲占比最高。無規則卷曲的增加易改變蛋白質構象，進而影響其生物學功能（鄭海軍等，2013），但由于使用的預測軟件不同，致使其他結構區域的占比略有差異，因此雞MSTN蛋白的結構與功能還需進一步探究。

4 結論

MSTN基因在貴州地方白羽雞種中的多態性較豐富，其中A60G、G195C、C297T和C324T等4個SNPs位點突變會導致基因mRNA二級結構的構象發生改變，可作為改善白羽雞肉質品質的分子遺傳標記進一步研究。

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（責任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2019-12-29

基金項目：貴州省科技計劃項目（黔科合支撐〔2016〕2507號）

作者簡介：*為通訊作者，張福平（1978-），博士，副教授，主要從事家禽育種研究工作，E-mail：zfu-1010@126.com。龍廣麗（1994-），研究方向為畜牧養殖，E-mail：632816729@qq.com