大豆脫落酸受體基因家族鑒定、系統發育進化及表達模式分析

張兆涵　張天旭　王萬鵬　解莉楠

摘要：【目的】鑒定大豆脫落酸受體基因（GmPYLs）家族成員，并進行系統發育進化及表達模式分析，為深入研究該基因家族在大豆生長發育和非生物脅迫中的作用機制提供理論依據。【方法】以擬南芥PYLs基因（AtPYLs）家族成員序列為參考，從JGI和NCBI數據庫鑒定出GmPYLs基因家族成員;利用生物信息學方法對該基因家族的組成、基因結構、保守性、系統進化、啟動子區順式作用元件及其編碼蛋白理化性質和結構域等進行全面分析，并基于轉錄組測序數據，對GmPYLs基因家族成員的表達模式進行分析。【結果】從大豆全基因組序列中鑒定出21個GmPYLs基因，長度為500～4000 bp，分布在15條染色體上，編碼蛋白的氨基酸數量為178～267個，分子量為19457.11～29105.43 Da，理論等電點（pI）為4.82～7.23，均為親水蛋白，但穩定性存在明顯差異，主要定位于細胞質中。GmPYLs蛋白的二級結構以α-螺旋和無規則卷曲為主。GmPYLs基因家族成員可分為四大組，同一組成員基因結構及其編碼蛋白的氨基酸序列、三級結構、結構域和保守基序（motif）均相似。大豆、擬南芥、苜蓿和水稻的PYLs基因被分為五大類群（Ⅰ～Ⅴ），大豆、擬南芥、水稻和苜蓿的大多數PYLs基因歸于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類群;Ⅳ類群含少量的擬南芥和大豆PYLs基因，而Ⅴ類群僅含少部分苜蓿PYLs基因。擬南芥與大豆直系同源基因對數量多于擬南芥與苜蓿直系同源基因對數量。21個GmPYLs基因的啟動子序列主要包含響應逆境脅迫、調節生長發育及響應植物激素的順式作用元件，且所有GmPYLs基因的啟動子區至少含有1個植物激素響應元件，其中，以含ABA響應元件的GmPYLs基因數量最多。GmPYLs基因具有組織表達特異性，且品種間的表達模式也存在差異。【結論】GmPYLs基因家族成員在系統發育進化上較保守，其基因組復制事件可能發生在豆科植物分化以后，且大部分GmPYLs基因被保留，在響應非生物脅迫中存在廣泛的潛在機制，尤其與激素響應密切相關。

關鍵詞： 大豆;GmPYLs;基因家族;鑒定;系統進化;非生物脅迫;表達分析

中圖分類號： S565.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）08-1904-13

Identification，phylogenetic evolution and expression analysis of abscisic acid receptors gene family in Glycine max L. Merr

ZHANG Zhao-han， ZHANG Tian-xu， WANG Wan-peng， XIE Li-nan*

（College of Life Science， Northeast Forestry University/Key Laboratory of Saline-alkali Vegetation Ecology Restoration，Ministry of Education， Harbin? 150040， China）

Abstract：【Objective】The abscisic acid receptor gene family in Glycine max L. Merr GmPYLs was identified by bioinformatics，and analyzed its evolution model and expression pattern. The purpose of this study was to provide a theoretical basis for in-depth study of the role of PYL gene in soybean development and abiotic stress. 【Method】The reported members of PYLs gene family in Arabidopsis thaliana（AtPYLs） were used as a reference，and the members of GmPYLs gene family were identified by JGI and NCBI databases. The gene family composition，gene structure，conservatism，evolutionary relationship，cis-acting element of promoter region， and its coding protein physicochemical properties and domain were analyzed by bioinformatics method. Based on high throughput transcriptome sequencing data，the expression patterns of GmPYLs gene family members were analyzed. 【Result】In this study，21 GmPYLs genes were identified from soybean whole genome sequence， which were distributed on 15 chromosomes with a sequence length of 500-4000 bp. The protein encoded was 19457.11-29105.43 Da in molecular weight， amino acids number was 178 to 267， theoretical isoelectric point（PI） was 4.82-7.23，which was hydrophilic protein mainly distributed in the cytoplasm. But the stability was different. The secondary structure of the protein was mainly α-helix and random coil. The GmPYLs gene family could be divided into four groups. In the same group，the gene structure，amino acid sequence of conded protein，protein tertiary structure，functional domain and conserved motif were very similar. The PYLs genes of G. max， Arabidopsis thaliana， Oryza sativa and Medicago truncatula were divided into five groups （Ⅰ-Ⅴ）. Most of the PYLs genes in G. max， Arabidopsis thaliana， Oryza sativa and Medicago truncatula were classified into groups Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ. Group IV contained a small amount of AtPYLs and GmPYLs genes， while group Ⅴ contained only a small part of MtrPYLs genes. The promoter sequences of 21 GmPYLs genes mainly contained cis-acting elements that responded to stress， regulate growth and respond to plant hormones. The promoter regions of all GmPYLs genes contained at least one hormone response element， of which the largest number of GmPYLs genes containing ABA response elements. The results of transcriptome sequencing analysis showed that GmPYLs gene had tissue-specific expression|， and there were differences in the expression patterns between different varieties. 【Conclusion】Members of the GmPYLs gene family are conservative in phylogenetic evolution， and their genome replication events may occur after legume differentiation， and most of the GmPYLs genes are retained. There are a wide range of potential mechanisms in response to abiotic stress， closely related to hormone response.

Key words： soybean; GmPYLs; gene family; identification; systematic evolution; abiotic stress; expression analysis

Foundation item： National Natural Science Foundation of China for Young Scholars（31801444）

0 引言

【研究意義】大豆（Glycine max L. Merr ）是我國重要的經濟作物，具有極高的營養價值，是人類獲取植物蛋白的主要來源，在世界范圍內廣泛種植。干旱、鹽堿和極端溫度等非生物脅迫嚴重制約大豆的產量和品質。PYR（Pyrabactin resistance）/PYL（PYR1-like）/RCAR（Regulatory components of ABA receptor）（簡稱PYL）蛋白家族作為脫落酸（ABA）的直接受體，在響應ABA介導的非生物脅迫過程中發揮重要作用（Ma et al.，2009;Park et al.，2009;Rodriguez et al.，2014）。因此，鑒定大豆PYLs基因（GmPYLs）家族成員，分析其進化及表達模式，以期深入了解大豆響應非生物脅迫的分子機制，對提高大豆抗脅迫能力具有重要竟義。【前人研究進展】PYL蛋白位于ABA信號轉導途徑中的頂端，以抑制2C型蛋白磷酸酶（PP2C）活性作為主要調控方式（Park et al.，2009）。在缺乏ABA時，PYL蛋白不與PP2C結合，因此PP2C活性很高，從而阻止SNF1相關蛋白激酶2（SNF1-related protein kinases 2，SnRK2）及其下游因子的活化;當存在ABA時，PYL結合PP2C，抑制PP2C活性（Melcher et al.，2009;Miyazono et al.，2009），被抑制的PP2C釋放SnRK2，隨后SnRK2磷酸化，激活ABA響應元件結合因子（ABA-responsive elements bin-ding factors，ABFs），從而啟動下游因子響應逆境（Soon et al.，2012）。因此，PYL蛋白在ABA信號轉導途徑發揮重要作用，間接調控植物響應非生物脅迫（Miao et al.，2006;Yu et al.，2015）。迄今，已有較多有關PYLs基因的研究報道，陸續從擬南芥（Ma et al.，2009）、葡萄（Boneh et al.，2012）、水稻（He et al.，2014）、番茄（González-Guzmán et al.，2014）、玉米（李鴻杰等，2015）、橡膠樹（Guo et al.，2017）、棉花（Chen et al.，2017）和苜蓿（黃思源等，2019）中分別鑒定出14、8、13、14、21、27、13和14個PYL蛋白。其中，部分PYL蛋白的生物學功能已被驗證。如ABA以不依賴于AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL4的方式啟動擬南芥保衛細胞中的MeJA信號（Ye et al.，2016）;過表達AtPYL4、AtPYL8和AtPYL13基因可增強擬南芥的耐旱性（Santiago et al.，2009;Fuchs et al.，2014;Pizzio et al.，2017;Quan et al.，2018）;過表達AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL3基因可提高擬南芥的抗旱性和水分利用率（Li et al.，2018）;過表達AtPYL5基因可降低干旱脅迫下擬南芥植株的蒸騰速率，減少水分損失，減輕氧化脅迫傷害，進而提高光合作用效率（Quan et al.，2018）;AtPYR1和AtPYL2是脫落酸誘導氣孔關閉的關鍵受體（Dittrich et al.，2019）;AtPYL8和AtPYL9蛋白在擬南芥側根生長中發揮重要作用（Zhao et al.，2014，2016）。此外，過表達玉米ZmPYL8、ZmPYL9和ZmPYL12基因可提高植株的耐寒性（He et al.，2018）;敲除水稻OsPYL1、OsPYL4和OsPYL6基因可提高水稻的產量（Miao et al.，2018）;過表達小麥TaPYL4基因可減少蒸騰作用并增強光合作用以提高水分利用效率和抗旱性（Mega et al.，2019）;玉米ZmPYL9基因響應干旱脅迫和ABA誘導，導致該基因的表達量明顯提高（王延召等，2020）。【本研究切入點】目前，針對PYLs基因家族的研究主要集中在擬南芥、棉花、番茄、水稻和苜蓿等模式植物，雖然GmPYLs基因家族已被鑒定（Bai et al.，2013），但目前在JGI數據庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中尚未找到本研究鑒定得到的2個基因（GmPYL19和GmPYL22），也未進行全面的生物信息學分析。【擬解決的關鍵問題】以擬南芥PYLs基因（AtPYLs）家族成員序列為參考，利用JGI和NCBI數據庫從大豆全基因組鑒定出GmPYLs基因家族成員;利用生物信息學方法對該基因家族的組成、基因結構、保守性、進化關系、啟動子區順式作用元件及其編碼蛋白的理化性質和結構域等進行全面分析，并基于高通量轉錄組測序數據，對GmPYLs基因家族成員的表達模式進行分析，為探究該基因家族的生物學功能及其在大豆生長發育和響應非生物脅迫中的調控作用提供理論依據。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

供試大豆品種為Williams 82和Jack，由東北林業大學生命科學學院提供。主要試劑：RNA提取試劑盒（北京百泰克生物技術有限公司）、無水乙醇（天津市永大化學試劑有限公司）。

1. 2 樣品采集及RNA提取

將大豆種子種植于溫室（26 ℃，光照14 h/黑暗10 h）中，待幼苗的第一片真葉充分展開后，選取長勢一致的幼苗，采集其頂端分生組織、真葉、上胚軸、下胚軸和根。每個組織設3個獨立的生物學重復，放入液氮速凍，提取總RNA。高通量轉錄組測序由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1. 2 GmPYLs基因家族鑒定

從TAIR數據庫（https：//www.arabidopsis.org/）查找14個AtPYLs基因及其編碼蛋白的相關信息，并在JGI數據庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）進行氨基酸序列同源比對，篩選出與AtPYLs蛋白同源的GmPYLs候選蛋白。通過NCBI數據庫進行BLASTp比對分析，最終確定GmPYLs基因家族成員，并命名。

1. 3 系統進化分析

從NCBI數據庫（http：//plants.ensembl.org/index.html）中獲取苜蓿PYLs基因（MtrPYLs）家族成員和水稻PYLs基因（OsPYLs）家族成員編碼蛋白氨基酸序列。利用MEGA 10.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構建系統發育進化樹，并使用Bootstrap（自展法）進行3000次可信度檢測，分析GmPYLs基因家族與AtPYLs、MtrPYLs和OsPYLs基因家族的系統進化關系。

1. 4 基因結構及保守性分析

通過NCBI數據庫獲得大豆全基因組序列信息，利用TBtools提取GmPYLs基因序列信息，采用GSDS（Gene structure display server）在線分析GmPYLs基因結構。使用DNAMAN 6.0對GmPYLs、AtPYLs、MtrPYLs和OsPYLs蛋白進行氨基酸序列比對;利用MEME和TBtools分析GmPYLs蛋白的保守motif;并以SMART在線分析GmPYLs蛋白的結構域。

1. 5 染色體定位與共線性分析

在NCBI數據庫中獲取GmPYLs基因的染色體定位信息，利用MapChart繪制染色體定位圖。運用MCScanx和TBtools分析GmPYLs基因家族成員間及其與AtPYLs和MtrPYLs間的共線性關系，闡釋不同物種PYLs基因家族間的復制事件，確定直系同源基因和旁系同源基因。

1. 6 啟動子序列分析

在NCBI數據庫中提取GmPYLs基因家族成員起始密碼子上游2000 bp基因組序列，利用PlantCARE在線分析啟動子區順式作用元件。

1. 7 理化性質分析、亞細胞定位及結構預測

利用ProtParam在線分析GmPYLs和AtPYLs蛋白的分子量、等電點、穩定性、親/疏水性等理化性質。使用PSORT II Prediction預測GmPYLs蛋白的亞細胞定位情況;采用SOPMA和SWISS-MODEL預測GmPYLs蛋白的二、三級結構。

1. 8 表達特性分析

表達量數據由高通量轉錄組測序獲取，測序平臺為Illumina HiseqTM 2500，每個樣品產生6.0 Gb測序數據，測序方式為雙末端（PE）測序，讀長為150 bp，將轉錄組分析通用的FPKM（Fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）值作為基因的表達量，分析GmPYLs基因的組織表達特異性及品種間表達差異。

1. 9 統計分析

利用Excel 2016統計試驗數據，并采用T-test進行顯著性差異分析。

2 結果與分析

2. 1 GmPYLs基因家族鑒定及命名

根據氨基酸序列相似性比對及NCBI數據庫BLASTp序列驗證，最終獲得21個GmPYLs基因，命名為GmPYL1～GmPYL21，其基因長度、染色體位置及編碼氨基酸數量如表1所示。21個GmPYLs基因序列長度為570～3927 bp，編碼蛋白的氨基酸數量為178～267個。

2. 2 系統發育進化分析結果

由圖1可知，大豆、擬南芥、苜蓿和水稻的PYLs基因被分為五大類群（Ⅰ～Ⅴ），其中，大豆、擬南芥、水稻和苜蓿的大多數PYLs基因歸屬于Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類群，Ⅳ類群含少量的擬南芥和大豆PYLs基因，而Ⅴ類群只有少部分苜蓿PYLs基因，說明PYLs基因在植物進化及分化過程中相對保守，在不同物種間未發生明顯變異;21個GmPYLs基因成員分布在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ類群中，其中，Ⅰ類群有8個成員，Ⅱ類群有6個成員，Ⅲ類群有5個成員，Ⅳ類群有2個成員;在Ⅰ～Ⅲ類群中，GmPYLs基因數量明顯多于AtPYLs基因數量，推測在十字花科和豆科植物分化后大豆全基因組發生復制事件并保留下較多基因。Ⅳ類群中GmPYLs基因數量少于AtPYLs基因數量，說明Ⅳ類群PYLs基因在大豆全基因組復制事件中可能發生丟失。故推測相同類群的基因結構及其編碼蛋白的結構和功能域相似。

2. 3 GmPYLs基因家族的基因結構及其編碼蛋白結構分析結果

由GmPYLs基因家族的系統發育進化樹（圖2-A）可知，21個GmPYLs基因可分為四大組（Ⅰ～Ⅳ），僅Ⅲ組中的5個GmPYLs基因存在內含子，其他16個GmPYLs基因均無內含子（圖2-B）。蛋白保守基序（motif）分析結果顯示，從GmPYLs和AtPYLs蛋白中共鑒定出10個保守motif（motif 1～motif 10）（圖2-C），長度為8～50個氨基酸（表2），其蛋白保守結構域的氨基酸序列分布情況如圖2-D所示。所有GmPYLs蛋白共有的motif為motif 1、motif 2和motif 3，與多序列比對分析結果（圖3）一致。在同一組內系統發育進化樹同一節支點的基因具有相似的保守motif結構（圖2-A和圖4）。結構域預測結果顯示，21個GmPYLs蛋白均包含1個共有的聚酮環化酶結構域2（Pfam：Polyketide_cyc2），部分GmPYLs蛋白含有3個特有的結構域：聚酮環化酶結構域（Pfam：Polyketide_cyc）、樺樹花粉蛋白結構域（Pfam：Bet_v_1）和過氧化物酶結構域（Pfam：peroxidase）（圖4和表3）。其中，Pfam：peroxidase是GmPYL14蛋白所特有，說明其可能行使與其他GmPYLs基因不同的生物學功能，如負責清除葉綠體和細胞質中的過氧化氫及其他氧化有毒化合物等。

2. 4 GmPYLs基因家族的染色體定位及共線性分析結果

利用MapChart繪制GmPYLs基因家族成員在染色體上的位置，結果如圖5所示。21個GmPYLs基因分別位于1、2、3、4、6、7、8、9、11、13、14、15、16、17和18號染色體上，其中1號染色體上分布的GmPYLs基因數量最多，為3個，其次是6、7、13和14號染色體上分布的GmPYLs基因數量，均為2個，其他染色體僅包含1個基因。共線性和復制基因分析結果（圖6-A）顯示，GmPYL1/2/3/4、GmPYL5/6/7/8、GmPYL9/10/11、GmPYL12/13/14、GmPYL15/16、GmPYL17/19和GmPYL20/21均發生片段復制，且片段復制使基因數目增多，尤其是Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類群的基因數目。在對擬南芥、大豆和苜蓿3個物種的直系同源基因進行對比分析，結果（圖6-B）發現，擬南芥與大豆直系同源基因對數量多于擬南芥與苜蓿直系同源基因對數量，說明PYLs基因的基因組復制事件可能發生在豆科植物分化以后，且3個物種間直系同源基因對數量較多，也間接表明同源基因序列間高度的保守性和相似性。

2. 5 GmPYLs基因家族的啟動子區序列分析結果

為了預測GmPYLs基因家族的功能，對其啟動子區的順式作用元件進行分析，結果（圖7）顯示，GmPYLs基因家族的啟動子序列主要包含響應逆境脅迫、調節生長發育及響應植物激素的順式作用元件。其中，響應逆境脅迫的順式作用元件主要包括創傷響應元件、防御和壓力響應元件、低溫響應元件和干旱響應元件，說明GmPYLs基因家族在響應非生物脅迫方面存在廣泛的潛在機制，如GmPYL15基因啟動子區包含6個參與干旱誘導的MYB結合位點，說明GmPYL15蛋白可能調節某些MYB相關基因的轉錄，以響應干旱脅迫。調節生長發育的順式作用元件包括種子特異性調控元件、頂端分生組織表達元件、晝夜節律調控元件及參與類黃酮生物合成基因調控的MYB結合位點，如GmPYL9和GmPYL12基因啟動子區包含種子特異性調控元件，GmPYL17基因啟動子區包含參與類黃酮生物合成基因調控的MYB結合位點。說明GmPYL9和GmPYL12基因可能在種子發育過程中發揮重要作用，而GmPYL17基因可能參與類黃酮合成。GmPYLs基因家族共含有5種植物激素響應元件，包括ABA響應元件、赤霉素（GAs）響應元件、生長素（IAA）響應元件、響應茉莉酸甲酯（MeJA）應答的元件和水楊酸（SA）響應元件。其中，以含ABA響應元件的GmPYLs基因數量最多，為15個，其次是含MeJA響應元件的GmPYLs基因數量，為14個;GmPYL2、GmPYL16和GmPYL20基因均包含4個激素響應元件，GmPYL13、GmPYL14、GmPYL17和GmPYL19基因均包含3個激素響應元件，說明這7個基因在激素響應方面可能發揮重要調控作用。

2. 6 GmPYLs蛋白理化性質分析、亞細胞定位及結構預測結果

GmPYLs蛋白理化性質如表4所示。GmPYLs蛋白的分子量為19457.11～29105.43 Da，理論等電點（pI）4.82～7.23，均為親水蛋白，但穩定性存在明顯差異，由此推測其在不同微環境中行使的功能。亞細胞定位結果顯示，GmPYLs蛋白主要定位在細胞質（圖8-A）。利用SOPMA預測GmPYLs蛋白二級結構，結果（圖8-B）表明GmPYLs蛋白二級結構均以α-螺旋和無規則卷曲為主，其次是β-折疊，β-轉角最少。GmPYLs蛋白三級結如圖8-C所示，位于系統發育進化樹節支點的GmPYLs蛋白具有類似三級結構，如GmPYL1～GmPYL4具有相似三級結構，GmPYL5～ GmPYL8也存在相似的三級結構，因此推測三級結構相似的GmPYLs蛋白具有相似的生物學功能。

2. 7 GmPYLs基因家族的表達特異性分析結果

鑒于幼苗子葉期是大豆受非生物脅迫最敏感的階段，本研究選取2個代表性的大豆品種Williams 82和Jack分析其GmPYLs基因家族成員在子葉期幼苗的頂端分生組織、真葉、上胚軸、下胚軸和根中的表達模式。品種間的表達量差異分析結果（圖9）顯示，品種間基因表達量差異極顯著（P<0.01）的基因包括頂端分生組織中的GmPYL1、GmPYL15和GmPYL19基因，真葉中的GmPYL4、GmPYL9、GmPYL10、GmPYL11、GmPYL16和GmPYL19基因，上胚軸中的GmPYL1、GmPYL2、GmPYL3和GmPYL9基因，下胚軸中的GmPYL1、GmPYL3、GmPYL4、GmPYL9、GmPYL10、GmPYL11和GmPYL15基因，以及根中的GmPYL1、GmPYL3、GmPYL4、GmPYL9、GmPYL10、GmPYL11、GmPYL13、GmPYL14、GmPYL15、GmPYL16和GmPYL19基因。組織特異性表達結果（圖10）顯示，GmPYLs基因具有組織表達特異性，Williams 82中的GmPYL1和GmPYL9基因分別在上胚軸和真葉表達，且其表達量均高于其他器官，Jack中的GmPYL10基因在根中表達量均高于其他器官，說明GmPYL9和GmPYL10基因不僅具有組織器官特異性，還在品種間差異表達;GmPYL19基因在5個組織中的表達量均表現為Jack高于Williams 82，說明GmPYL19基因可能在Jack品種響應非生物脅迫方面發揮重要調控作用。此外，Williams 82和Jack品種間在根中的差異表達基因居多，且大多數基因表達量表現為Jack高于Williams 82，說明這2個品種根中的工作基因存在明顯差異;GmPYL5、GmPYL6、GmPYL7、GmPYL8、GmPYL20和GmPYL21在2個品種中的表達量非常低，說明這些基因功能可能已冗余，或不在子葉期表達。

3 討論

本研究中GmPYLs基因家族的系統發育進化和序列保守性分析結果顯示，21個GmPYLs基因分成四大組，同一組中的基因結構較相似，且系統發育進化樹中同一節支點內保守motif和三級結構也高度相似，故推測同組基因具有類似的調控功能。前人的研究也發現，AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL3基因均能促進ABA誘導的氣孔關閉（Nishimura et al.，2010;Wang et al.，2013;Yin et al.，2013）。本研究的系統進化分析結果顯示，GmPYL1、GmPYL2、GmPYL3、GmPYL4與AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2、AtPYL3基因直系同源，暗示這些基因可能也具有促進ABA誘導的氣孔關閉生物學功能。GmPYLs蛋白均包含Pfam：Bet_v_1、Pfam：Polyketide_cyc和Pfam：Polyketide_cyc2結構域，其中，Pfam：peroxidase是GmPYL14基因所特有，說明GmPYL14蛋白可能在GmPYLs基因家族中具有除響應ABA信號以外的其他功能。由于Pfam：peroxidase結構域在植物中主要負責清除葉綠體和細胞質中的過氧化氫及其他氧化有毒化合物，且參與細胞壁生物合成、傷害防御反應、IAA分解代謝及乙烯生物合成等（http：//pfam.xfam.org/family/peroxidase），故推測GmPYL14蛋白也具有相似功能。Pfam：Polyketide_cyc和Pfam：Polyketide_cyc2是START結構域超家族成員，其蛋白折疊具有保守的配體結合模式，以適應各種催化活性和非催化調節功能;Pfam：Bet_v_1是樺樹花粉蛋白結構域（Ma et al.，2009），與Pfam：Polyketide_cyc結構域同源（Iyer et al.，2001），且在位置上互相重疊。這些結構域是PYL蛋白作為ABA直接受體的關鍵，通過結合PP2C而負調控ABA核心信號通路（Fujii et al.，2009）。由于大豆是古四倍體生物，在基因家族中存在一定程度上的功能冗余，對同一組別的GmPYLs基因進行多基因編輯，有利于高效實現研究目標。

本研究的GmPYLs基因啟動子順式作用元件分析結果顯示，Ⅲ組中的GmPYL17、GmPYL18和GmPYL19基因位于系統發育進化樹同一節支點上，均包含IAA響應元件。而前人的研究結果表明，AtPYL8以不依賴于ABA核心信號通路（PYL-PP2C-SnRK2）的方式促進響應IAA的相關基因轉錄，從而解除ABA核心信號通路對側根生長的抑制，促進側根生長（Zhao et al.，2014）。本研究中不同物種的PYLs基因系統發育進化樹分析結果顯示，GmPYL17、GmPYL18和GmPYL19基因與AtPYL8基因歸于Ⅲ類群，表明四者親緣關系較近。由此推測，GmPYL17、GmPYL18和GmPYL19基因可能在大豆中也參與調控側根生長。本研究還發現，所有GmPYLs基因至少包含1個植物激素響應元件，而植物激素信號是響應干旱或水分不足的關鍵，故推測GmPYLs基因家族在干旱響應中發揮至關重要的作用。

PYL作為ABA的直接受體，參與植物多種非生物脅迫響應。前人的研究結果表明，AtPYL5基因過表達可降低干旱脅迫下植株的蒸騰速率，減少水分損失，減輕氧化脅迫傷害，進而提高光合作用（Quan et al.，2018）。本研究發現，GmPYL9基因在葉中的表達量較高，在今后的研究中可深入探究其表達量與光合速率和蒸騰速率的相關性。此外，AtPYR1、AtPYL1、AtPYL2和AtPYL3基因過表達可提高擬南芥的抗旱性和水分利用率（Li et al.，2018）。在本研究構建的不同物種PYLs基因系統發育進化樹中，GmPYL1～GmPYL8基因與上述基因同歸于Ⅰ類群，故推測這些基因也具有類似的生物學功能，可提高大豆的抗旱性和水分利用率。本研究通過轉錄組數據分析發現，GmPYLs基因家族具有組織表達特異性，且品種間的表達模式也存在差異。與大豆不同器官轉錄組在線數據（http：//bar.utoronto.ca/eplant/）（Libault et al.，2010）相比，本研究中GmPYLs基因家族成員具有相似的表達模式，證明本研究結果的可靠性。

PYLs是植物中復雜且龐大的基因家族。通過對模式植物擬南芥在逆境脅迫下的生理和分子水平進行分析，研究人員揭示了植物如何通過ABA應對干旱脅迫，包括對基因表達進行重新編程、關閉氣孔及調節滲透等，最終實現植株適應性生長發育（Gong et al.，2020）。基于上述植物抗逆分子機理研究對重要經濟作物進行遺傳改良，從而獲得高抗逆性植物材料。本研究利用大豆基因組和轉錄組數據，對GmPYLs基因家族進行全面分析，為研究GmPYLs基因響應非生物脅迫和生長發育的機制及GmPYLs基因的定向研究提供了理論依據。在后續研究中，應對GmPYLs基因家族成員進行多重基因編輯，分析其對大豆生長發育及應對非生物脅迫具體表型效應影響。

4 結論

GmPYLs基因家族成員在系統發育進化上較保守，其基因組復制事件可能發生在豆科植物分化以后，且大部分GmPYLs基因被保留，在響應非生物脅迫中存在廣泛的潛在機制，尤其與激素響應密切相關。

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（責任編輯 陳 燕）

收稿日期：2020-05-13

基金項目：國家自然科學基金項目（31801444）

作者簡介：*為通訊作者，解莉楠（1977-），博士，副教授，主要從事植物抗逆生物學研究工作，E-mail：linanxie@nefu.edu.cn。張兆涵（1994-），研究方向為大豆抗逆生物學，E-mail：zhangzhaohan@nefu.edu.cn