高效液相色譜法測定煙田土壤中二氯喹啉酸殘留量

石 妍 ，肖 順 ，周 挺 ，梁頒捷 ，張珊珊 ，張紹升 ，劉國坤 ，顧 鋼 *

（1.福建農林大學植物保護學院，福州 350002；2.福建省煙草公司煙草科學研究所，福州 350003；3.福建省煙草公司三明市公司，福建三明 365000）

二氯喹啉酸是一種激素型喹啉羧酸類除草劑[1]，主要用于稗草的防治。由于其具有適用期長、用量少、使用間隔期寬等優點[1-2]，在我國水稻種植區廣泛使用。二氯喹啉酸在土壤中降解緩慢[3]，由于不科學的使用，造成其在土壤中積累，易對后茬輪作敏感作物，如茄科、豆科、傘形花科等作物，產生藥害。在水稻與煙草輪作區，土壤中殘留的二氯喹啉酸可造成煙葉生長畸形[3-5]，表現為煙葉扭曲、黃化，葉片較小等，給煙農帶來經濟損失。因此，檢測土壤中二氯喹啉酸的殘留具有重要意義。

關于二氯喹啉酸殘留檢測最常用的方法是高效液相色譜法[1-2，4-11]，而氣相色譜法[12-13]和毛細管電泳法[14]使用較少。高效液相色譜法前處理較簡單，但對于不同地區土壤樣品中二氯喹啉酸的提取，其前處理方法不盡相同。如陳虹等[1]以甲醇＋0.05 mol/L硼砂溶液（體積比9∶1）為提取溶劑，離心后取上清液旋轉蒸發濃縮，甲醇定容，HPLC法測定。鄭雄志等[2]以0.05 mol/L氫氧化鈉溶液為提取溶劑，提取液離心后調成酸性，用乙酸乙酯萃取，收集乙酸乙酯相，旋轉蒸發濃縮后，甲醇定容，HPLC法測定。李麗春等[5]以甲醇＋0.05 mol/L硼砂溶液為提取溶劑，提取液調成酸性后用二氯甲烷萃取，經濃縮后甲醇定容，HPLC法測定。本研究以福建煙區土壤為樣本，通過對儀器相關條件和樣品的前處理方法進行優化，建立高效液相色譜檢測煙田土壤中二氯喹啉酸殘留量的方法。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

二氯喹啉酸標準品（純度為98%），上海阿拉丁生化科技股份有限公司；色譜級甲醇，德國Merck公司；硼砂、乙酸、氫氧化鈉、乙酸乙酯、磷酸、無水硫酸鈉均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司。

土壤樣品：由福建省三明市清流縣煙草試驗站提供，采集方法參照NY/T 39—2012《農田土壤環境質量監測技術規范》[15]中的方法。

1.2 儀器設備

Waters e2695高效液相色譜儀，美國Waters公司；N-1100D-W旋轉蒸發儀，上海愛朗儀器有限公司；Avanti J-E離心機，美國Beckman Coulter有限公司；Milli-Q超純水機，美國Millipore科學儀器公司；KQ-2200DE超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；Practum224-1CN電子天平，北京賽多利斯科學儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 土壤樣品預處理

土壤樣品經風干、去除雜物后研磨過20目篩（孔徑0.83 mm），于-20℃冰箱冷藏備用[15]。

1.3.2 土壤樣品提取

選取2種以堿性溶液提取土壤中二氯喹啉酸的方法，比較這2種方法的回收率及對二氯喹啉酸的分離效果。

（1）參考陳虹等[1]的方法，稍作改動。稱取10.0 g土樣于150 mL具塞三角瓶中，加入30 mL甲醇＋0.05mol/L硼砂溶液（體積比9∶1）作為提取液，渦旋混勻1 min，超聲振蕩提取2 h[1]。然后將提取液轉入離心管中，以5 000 r/min轉速離心5 min。取上清液，用無水硫酸鈉去除上清液中殘余水分，取15 mL濾液于50 mL圓底燒瓶中，用旋轉蒸發儀濃縮至接近干燥狀態，再用1.5 mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜后即得待測液。

（2）參考鄭雄志等[2]的方法，稍作改動。稱取土樣10.0 g，置于150 mL具塞三角形瓶中，加入提取液0.05 mol/L氫氧化鈉溶液30 mL，渦旋混勻1 min，超聲振蕩提取2 h。然后將提取液轉入離心管中，以5 000 r/min轉速離心5 min。取上清液15 mL，用磷酸調節pH為2.5左右，然后用乙酸乙酯萃取2次，每次用量為15 mL，合并乙酸乙酯相[2]。用旋轉蒸發儀濃縮至接近干燥狀態，用1.5 mL甲醇溶解，過0.22 μm濾膜后即得待測液。

1.3.3 液相分析

1.3.3.1 標準溶液的配制

準確稱取適量二氯喹啉酸標準品，用甲醇（色譜級）配成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液。將儲備液放入4℃冰箱保存，使用時再稀釋配成所需的標準工作溶液。

1.3.3.2 液相色譜檢測條件

流動相為甲醇＋1%乙酸水溶液（體積比65∶35）；流速為1.0 mL/min；柱溫為40℃；檢測波長為238 nm；進樣體積為20 μL；色譜柱為Diamonsil-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；檢測器為二極管陣列檢測器（PDA）。在此條件下，二氯喹啉酸的保留時間為5.027 min左右。

2 結果與分析

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 流動相的選擇

取質量濃度為10 mg/L的二氯喹啉酸標準溶液進行上機分析，比較不同體積比（65∶35，60∶40，55∶55）的甲醇＋1%乙酸水溶液作為流動相的分離效果。結果表明，在該試驗條件下，體積比為65∶35的甲醇＋1%乙酸水溶液作為流動相時出峰時間較早且溶劑吸收強度較小（圖1）。標樣及樣品經反復測試后，筆者選擇體積比為65∶35的甲醇＋1%乙酸水溶液作為流動相。

圖1 不同流動相體積比下二氯喹啉酸的液相色譜圖

2.1.2 檢測波長的選擇

在190～400 nm波長范圍內對質量濃度為10 mg/L的二氯喹啉酸標準溶液進行紫外波長掃描，獲得紫外吸收光譜圖。結果表明，二氯喹啉酸在226 nm處吸收最強，在226～238 nm處吸收較好，峰強度相差不大。然而，在實際檢測結果中發現，在226 nm和230 nm波長處的溶劑吸收峰強度較大（圖2）。因此，綜合考慮，筆者選擇238 nm作為檢測波長。

2.2 提取方法選擇

二氯喹啉酸屬于弱酸性物質（pH=4.35），在水中的溶解度很小，可溶于甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯等有機溶劑[1]。在堿性環境下，二氯喹啉酸轉化為鹽的形式，使其溶解性得以提高[1，11]。在查閱相關文獻的基礎上，筆者選取兩種以堿性溶液提取土壤中二氯喹啉酸的方法，比較兩種方法的回收率及對二氯喹啉酸的分離效果。對加標濃度為1.0 mg/kg的空白土壤樣品進行提取，每種方法重復3次。結果表明：方法1，即提取溶劑為甲醇＋0.05 mol/L硼砂溶液（體積比9∶1）的處理方法，回收率較高，且色譜峰分離較好，峰形對稱，平均回收率為93.40%；方法2，即提取溶劑為0.05 mol/L氫氧化鈉溶液的處理方法，回收率較低，分離效果較差，平均回收率為80.40%（圖3）。綜合考慮，本試驗選取甲醇＋0.05mol/L硼砂溶液（體積比9∶1）為提取溶劑，方法1作為本試驗的前處理方法。

圖2 二氯喹啉酸的液相色譜圖

圖3 土壤中二氯喹啉酸的液相色譜圖

2.3 方法學驗證

2.3.1 基質效應、標準曲線、檢出限和定量限

目前，基質效應（EM）常采用基質標準曲線的斜率與溶劑標準曲線的斜率之比進行評價[16-17]，當0.9≤EM≤1.1時，無明顯基質效應；當EM＜0.9時，表明存在基質抑制（減弱）效應；當EM＞1.1時，表明存在基質增強效應。

采用梯度稀釋法將二氯喹啉酸標準儲備液用甲醇逐級稀釋，配制成質量濃度分別為10.0、5.0、2.5、1.0、0.5、0.25 mg/L的6個標準工作溶液。同時用空白土壤基質提取液（按照1.3.2方法1中的前處理方法提取）為溶劑配制二氯喹啉酸標準溶液（濃度梯度與用甲醇配制的一致）。按1.3.3.2的液相色譜條件進行測定，以進樣質量濃度為橫坐標，色譜峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明不同基質中二氯喹啉酸質量濃度在0.25～10.0 mg/L范圍內與峰面積具有良好的線性關系。土壤EM值為1.05，說明無明顯基質效應，可忽略。

分別以3倍信噪比（S/N=3）和10倍信噪比（S/N=10）計算方法檢出限為0.005 mg/kg，定量限為0.025 mg/kg（表1）。

表1 二氯喹啉酸的基質效應、標準曲線、檢出限和定量限

2.3.2 加標回收率及精密度

以空白土壤樣品作為基質，添加高、中、低3個濃度水平的二氯喹啉酸標準溶液，振蕩混勻后室溫培養24 h，按照1.3.2方法（1）中的前處理方法及優化后的色譜條件進行加標回收率實驗，每個處理水平重復5次，連續測3 d。結果表明，在0.1、0.5、1.0 mg/kg加標水平下，二氯喹啉酸的平均回收率為93.40%～100.94%，日內和日間精密度分別為1.38%～8.09%，5.64%～6.16%（表2），說明本試驗方法的準確性較高，重現性較好，能滿足農殘分析的要求。

表2 二氯喹啉酸在土壤中的加標回收率（n=5）

2.4 實際土壤樣品測定

試驗所用的土壤樣品由福建省三明市清流縣煙草試驗站采集，采用1.3.2方法（1）中的前處理方法及優化后的色譜條件對供試的8個土壤樣品進行提取、測定，結果顯示8個送檢的土壤樣品均未檢出二氯喹啉酸（或低于檢出限）。實際分析測試樣品時，可根據樣品中二氯喹啉酸殘留量的高低，適當減少或增加稱樣量。

3 結論與討論

本試驗建立了高效液相色譜法檢測煙田土壤中二氯喹啉酸殘留量的方法。在優化的試驗條件下，二氯喹啉酸在土壤中的平均回收率為93.40%～100.94%，日內和日間精密度分別為1.38%～8.09%，5.64%～6.16%，檢出限為0.005 mg/kg，定量限為0.025mg/kg。該方法回收率較高，重現性較好，且前處理過程較簡單，分析時間短，有機溶劑用量較少，能滿足煙田土壤中二氯喹啉酸殘留量的快速檢測要求。

本試驗選取并對比了2種以堿性溶液提取土壤中二氯喹啉酸的方法，在此基礎上進行前處理方法和液相色譜條件的優化。其中方法1以甲醇/硼砂溶液為提取劑，超聲振蕩提取。離心后將提取液去除水分，濃縮，甲醇定容，得待測液。因提取液含有少量水分會增加減壓濃縮時間，故用無水硫酸鈉去除殘余水分后再濃縮，而陳虹等[1]的方法是將離心后的提取液用濾紙過濾后直接濃縮，用濾紙過濾可能會造成目標物的損失。方法2以氫氧化鈉溶液振蕩提取后再用乙酸乙酯萃取。該方法所需溶劑用量較多，液-液萃取過程中發現易形成乳液[18]，造成目標物的損失。實驗結果也表明方法1回收率較高且色譜峰分離較好、峰形對稱。因此，本試驗選用方法1作為前處理方法。對比陳虹等[1]和鄭雄志等[2]的方法，本研究所采用的前處理方法優勢在于減少了時間的消耗、溶劑的損耗和目標物的損失。通過對色譜條件的優化，實現對土壤中二氯喹啉酸的快速分離、檢測。此外，選取的兩種方法均是用振蕩器振蕩提取，本試驗選用超聲清洗器振蕩提取，結果同樣可行。雖然已有其他研究[3-14]報道了采用不同的提取方法或不同的色譜條件進行二氯喹啉酸的檢測分析，但實際分析檢測時還需根據不同地區的樣品和實驗條件建立最適合的方法。