肝細胞肝癌中TCF3表達及與預后的關系

謝 雪，石毓君，劉玉萍

肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是臨床上常見的惡性腫瘤之一。2015年我國新增肝癌病例達46.61萬，HCC引起的腫瘤相關死亡僅次于肺癌和胃癌，位居第三[1]。因此，探尋HCC發生過程的關鍵分子具有重要意義。本實驗分析了癌癥基因組圖譜(the cancer genome atlas, TCGA)數據庫中HCC的表達譜數據[2]，發現TCF3 mRNA(也稱為E2A)在腫瘤組織中高表達。作為E蛋白家族核轉錄因子的一員，TCF3蛋白參與大量基因的轉錄調控，在B淋巴細胞形成及淋巴瘤發生中發揮關鍵作用[3-4]；此外，TCF3還參與了結腸癌起始、上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)和轉移，以及胰腺癌細胞增殖等方面的調控[5]。由此可見，TCF3與腫瘤的發生密切相關，但其在HCC中的研究報道較少，僅有一項體外研究有所提及[6]。因此，本實驗利用TCGA數據庫及華西醫院收治的存檔HCC標本，分析TCF3蛋白表達與臨床病理特征、預后的相關性，并利用生物信息學手段分析了與TCF3 mRNA表達相關的基因及有關的信號通路，為深入研究HCC的發病機制及篩選可靠的預后標志物提供線索和依據。

1 材料與方法

1.1 數據收集、篩選和分析從TCGA官方網站的肝癌項目中(https://www.cancer.gov/)獲得374個HCC患者基因表達數據，包括374例HCC癌組織樣本和其中50例配對癌旁組織樣本測序結果。剔除臨床信息不完整的數據，最終保留240例HCC患者的完整數據進行進一步分析。

1.2 基因富集分析(gene set enrichment analysis, GSEA)采用Gsea-3.0軟件進行分析，利用GSEA網站MsigDB數據庫獲取c2.cp.kegg.v6.2.symbols.gmt數據集，按默認的加權富集統計方法進行富集分析，并將隨機組合次數設置為1 000次。以TCF3表達作為表型標記。利用P值和標準化富集評分(normalized enrichment score, NES)對每個表型的富集途徑進行排序。

1.3 TCF3抗體染色及評分收集2010年5月～2012年11月華西醫院肝臟外科確診并接受外科手術治療的HCC組織蠟塊100例，所有患者術前均未接受任何抗癌治療，患者與家屬均簽署知情同意書，同時收集患者相關臨床病歷資料。石蠟切片行免疫組化染色，結果由兩位資深病理學家根據染色強度和陽性比例對TCF3的表達結果進行評分。按陽性比例評分：陽性細胞數<5%為0分；5%～25%為1分；25%～75%為2分；>75%為3分；按染色強度評分：弱染色為1分；中等染色為2分；強染色為3分。將兩項評分結果相乘作為最終評分：0～3分為低表達，4～9分為高表達。

1.4 統計學分析采用RStudio包(v.3.6.1)及SPSS 22.0軟件進行統計學分析。采用Pearson相關性分析尋找與TCF3 mRNA表達相關的基因。采用Wilcoxon秩和檢驗和Logistic回歸分析TCF3 mRNA與臨床病理特征的關系。采用Cox回歸和Kaplan-Meier法分析HCC臨床病理特征與總生存率的關系。采用多變量Cox回歸方法分析TCF3表達對生存期及其他臨床特征(分期、分級等)的影響。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數據庫中TCF3 mRNA在HCC癌組織及癌旁組織中的表達及與臨床病理特征的關系分析TCGA數據庫中374例HCC癌組織和50例癌旁組織測序數據，TCF3 mRNA在HCC癌組織中的表達水平較癌旁組織上調(圖1A，P<0.001)；50例配對癌及癌旁組織配對分析結果顯示，癌組織中TCF3 mRNA表達水平較癌旁組織亦上調(圖1B，P<0.001)。TCF3 mRNA表達與HCC分級、臨床分期的相關性分析發現，隨著HCC臨床分期及分級的升高，TCF3 mRNA表達逐漸升高(圖1C、D)。單因素分析結果提示，TCF3 mRNA高表達、臨床分期、原發灶T分期及遠端轉移是HCC預后不良的危險因素(表1)。

表1 Cox回歸分析TCGA數據庫中TCF3 mRNA表達與HCC臨床病理特征的關系

圖1 TCF3 mRNA在肝癌及癌旁組織中的表達：A.TCF3 mRNA在癌旁組織和癌組織中的表達；B.TCF3 mRNA在配對癌及癌旁組織中的表達；C.TCF3 mRNA在不同臨床分期HCC中的表達情況；D.TCF3 mRNA在不同臨床分級HCC中的表達情況

2.2 HCC中TCF3 mRNA表達與患者生存分析的關系TCF3 mRNA高表達HCC患者比低表達者更容易發生腫瘤進展，預后更差(P=0.001，圖2A)。單因素分析顯示高表達TCF3 mRNA與不良總體生存期相關(P<0.001)，其他臨床病理特征包括臨床分期、原發灶T分期及遠端轉移(表1)。在多因素分析中，TCF3 mRNA表達(P<0.001)是HCC的獨立預后因素(表1，圖2B)。

圖2 A.TCF3 mRNA表達對HCC患者總生存的影響；B.TCF3 mRNA表達是HCC的獨立預后因素

2.3 GSEA篩選HCC中TCF3基因相關的信號通路本實驗使用GESA對TCF3高表達的組織進行富集分析，以識別HCC中激活的信號通路。在TCF3 mRNA高表達肝癌組織中，細胞周期、Wnt信號通路、腫瘤相關通路、磷脂酰肌醇信號系統、VEGF信號通路及Notch信號通路均有不同程度的富集(表2，圖3)。

圖3 GSEA富集分析TCF3高表達HCC中激活的信號通路

表2 表型高度富集的基因集

2.4 TCF3 mRNA表達相關基因分析根據各基因的表達水平，本實驗篩選出與TCF3 mRNA表達高度相關的2 937個基因(Pearson≥0.5，P<0.05)，其中TCF3與SMARCA4(又名Brg1)基因最為相關(Pearson=0.83，P<0.001)，同時還與細胞周期調控關鍵基因CDK4、E2F4等高度相關。對這些相關基因進行聚類分析，結果顯示這些基因與RNA剪切、ATP水解酶活性、轉錄共激活子活性等有關(圖4)。

圖4 TCF3 mRNA表達相關基因的Pearson系數分析：A～C.TCF3與SMARCA4(A)、CDK4(B)及E2F4(C)基因表達的Pearson相關性分析；D.與TCF3 mRNA表達相關基因的聚類分析結果

2.5 HCC中TCF3蛋白表達及與臨床病理特征及預后的關系通過免疫組化檢測100例HCC中TCF3蛋白的表達水平發現，TCF3蛋白在腫瘤組織中呈高表達(圖5)。根據其表達評分結果將HCC分為TCF3高表達組和低表達組，結合臨床病理信息，發現TCF3蛋白高表達與腫瘤大小和TNM分期有關(P<0.05)，與性別、年齡、AFP水平及肝硬化背景等無關(表3)。同時Cox單因素和多因素分析也顯示TCF3蛋白可作為HCC患者不良預后的獨立預后因素(表4)。生存分析結果顯示，TCF3蛋白高表達患者的無瘤生存率和總體生存率均比TCF3低表達者差(圖6)。

表4 Cox回歸分析肝癌患者的總生存期和臨床病理特征的關系

ABC圖5 肝組織中TCF3的表達,SP法:A.HCC癌旁正常組織中TCF3蛋白低表達;B.HCC腫瘤組織中TCF3蛋白低表達;C.HCC腫瘤組織中TCF3蛋白高表達

圖6 TCF3表達與患者無瘤生存(A)及總體生存(B)的關系

表3 肝癌中TCF3表達與臨床病理特征的關系

3 討論

HCC作為惡性程度較高的腫瘤之一，其發生過程涉及大量基因的表達紊亂，關鍵轉錄因子，如c-myc、p53、Sirt1等介導的轉錄重編程在包括HCC在內的多種腫瘤的細胞惡變過程中發揮著至關重要的作用[7-10]。尋找與肝細胞惡變密切相關的轉錄因子，對揭示HCC發生機制及建立有效的HCC治療手段都極為重要。本實驗利用TCGA數據庫及臨床HCC組織標本，系統性地分析發現了與HCC預后密切相關的轉錄因子TCF3，其高表達提示HCC患者預后不良。TCF3作為轉錄因子，屬于Ⅰ類bHLH家族，通過與組織特異性Ⅱ類HLH蛋白(同型二聚體或異二聚體)結合DNA來調控靶基因，在B細胞成熟過程中的作用被廣泛揭示，但其在腫瘤中的作用研究較少且存在較大爭議。TCF3可與EMT關鍵轉錄因子TWIST1形成復合物，促進EMT的發生及乳腺癌細胞的增殖[11-12]，而在結腸癌中TCF3低表達患者預后更差，TCF3缺失會導致結腸癌細胞增殖更快、更易轉移[13]。由此可見，TCF3在腫瘤發生過程中發揮了重要作用，且在不同腫瘤中的作用截然不同。根據GSEA分析結果發現，腫瘤相關信號通路包括細胞周期、Wnt信號通路、腫瘤相關通路、磷脂酰肌醇信號系統、VEGF信號通路及Notch信號通路在TCF3高表達樣本中均有不同程度的富集[14]；同時TCF3表達與細胞增殖關鍵基因SMARCA4、CDK4及E2F4等高度相關[15]。此外，根據HCC患者的臨床資料及TCF3表達情況，本組發現TCF3高表達與腫瘤大小及TNM分期有關，是HCC患者的獨立預后因素，可見即使TCF3與這些信號通路及基因的關系還未明確，但這些結果提示TCF3高表達可能促進了肝癌細胞增殖和HCC的進展，從而為控制腫瘤進展速度和增殖速度提供了治療上的靶點。

雖然一項體外研究報道丙肝病毒核心蛋白可以通過上調TCF3蛋白表達促進肝癌細胞EMT的發生[6]，但TCF3在HCC發生過程的具體分子機制遠未闡明。本實驗通過系統的分析TCF3基因和蛋白水平表達與臨床預后的關系，從臨床角度提出了TCF3與HCC發生、進展的密切關系，同時也為我們下一步深入研究其具體分子機制提供了線索。