lncRNA UG0898H09對前列腺癌細胞的增殖和遷移的影響

何 巖，吳春磊，李澤宇，宋偉航，李建昌，竇啟鋒

前列腺癌起源于前列腺上皮細胞，是男性泌尿生殖系統常見的一種惡性腫瘤，在西方國家男性惡性腫瘤中其發病率占首位，在我國男性惡性腫瘤中的發病率呈逐年增加趨勢[1]。探討前列腺癌發生、發展的相關機制，已成為前列腺癌防治研究的熱點。長鏈非編碼RNA(long-chain non-coding RNA, lncRNA)是一類缺乏開放閱讀框的單鏈RNA分子，由于不能編碼蛋白，lncRNA一直被認為不具有生物學功能[2]。近年來研究證實，大量lncRNA在多種腫瘤中表達異常，通過影響腫瘤細胞的增殖、分化、凋亡、血管形成、化療耐藥、放療敏感性等生物學行為，參與腫瘤的發生、發展[3-4]。隨著對lncRNA的研究，其在前列腺癌細胞中的作用逐漸被明確，有望成為前列腺癌早期診斷的標志物和治療靶點[5]。UG0898H09是一種新發現的lncRNA，其在腫瘤中的作用機制尚未見文獻報道。本實驗旨在檢測前列腺癌組織及細胞株中UG0898H09的表達，明確UG0898H09與前列腺癌發生、發展的相關性，觀察上調UG0898H09對前列腺癌細胞增殖和遷移的影響，初步探討UG0898H09在前列腺癌細胞中的作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料選取2018年2月～2019年10月新鄉醫學院第一附屬醫院泌尿外科存檔的手術切除前列腺癌組織和對應癌旁組織53例，術后標本均由本院病理科資深醫師確診，于液氮中冷凍保存。本研究經醫院倫理委員會批準，，患者均簽署知情同意書。人前列腺癌細胞株(PC-3、C4-2B、LNCaP、PC-3M和DU-145)及正常前列腺上皮細胞(RWPE-1)購于美國ATCC公司；表達UG0898H09的質粒、陰性對照質粒和PCR引物購于廣州瑞博生物公司；Lipofectamine 2000轉染試劑盒和Trizol試劑盒購于美國Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒、反轉錄試劑盒和WST-1細胞增殖試劑盒購自美國Sigma公司；RPMI 1640培養基、KSFM培養基和胎牛血清購于美國HyClone公司；一抗α-Tubulin、KLF4、Cyclin H、CDK7、N-cadherin和ZEB-1均購于美國CST公司。

1.2 細胞培養和轉染正常前列腺上皮細胞(RWPE-1)培養在含10%胎牛血清的KSFM培養基中，前列腺癌細胞株(PC-3、C4-2B、LNCaP、PC-3M和DU-145)培養在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養基中，在37 ℃、5%CO2飽和濕度的培養箱中培養。LNCaP細胞胰酶消化傳代后，按2×105個/孔接種于6孔板，按照隨機數字法分為陰性對照組和UG0898H09組。根據Lipofectamine 2000轉染試劑盒說明書分別轉染陰性對照質粒(陰性對照組)和表達UG0898H09的質粒(UG0898H09組)。

1.3 qRT-PCR法使用Trizol試劑盒提取組織和細胞中總RNA，反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA，熒光定量PCR試劑盒進行qRT-PCR反應。以GAPDH為內參比較UG0898H09和KLF4 mRNA的表達，以U6為內參比較miR-511-5p的表達。UG0898H09引物序列：上游5′-GCAGCTGCAGAAAGACACCT-3′，下游5′-ATGCTCAGACCCAAGCAGAG-3′。GAPDH引物序列：上游5′-TCCCATCACCATCTTCCA-3′，下游5′-CATCACGCCACAGTTTCC-3′。miR-511-5p引物序列：上游5′-CACTCAGCCTTGAGGGC-3′，下游5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′。KLF4引物序列：上游5′-CAGCTTCACCTATCCGATCCG-3′，下游5′- GACTCCCTGCCATAGAGGAGG-3′。qRT-PCR條件為95 ℃預變性60 s，95 ℃ 40 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s，連續進行40個循環。UG0898H09、miR-511-5p和KLF4 mRNA相對表達量以2-ΔΔCt表示。每組均設置4個平行反應復孔。

1.4 WST-1法檢測細胞增殖能力收集轉染48 h的兩組LNCaP細胞，重懸細胞后以4×103個/孔接種于96孔板，分別于培養第1、2、3、4、5天采用WST-1細胞增殖試劑盒檢測細胞增殖能力。檢測時，每孔加入WST-1試劑，培養箱內孵育4 h，酶標儀檢測每孔波長450 nm處的吸光度(OD)值，繪制細胞生長曲線。每組均設置4個平行反應復孔。

1.5 細胞劃痕實驗檢測細胞遷移能力收集轉染48 h的兩組LNCaP細胞，無血清培養基重懸細胞，接種于6孔板(接種細胞量以次日鋪滿培養板一層為宜)。接種24 h后，采用200 μL槍頭在6孔板中劃痕，PBS洗3次，分別于劃痕后0 h和24 h觀察細胞的遷移情況并拍照，計算遷移率=(0 h寬度-24 h寬度)/0 h寬度×100%。每組均設置4個平行反應復孔。

1.6 生物信息學技術分析UG0898H09的靶基因采用生物信息學網站starBase v2.0分析UG0898H09可互補結合的miRNA。采用生物信息學網站miRecords分析可互補結合的mRNA。

1.7 Western blot法收集轉染48 h的兩組LNCaP細胞，細胞裂解液提取總蛋白。采用10%SDS-PAGE膠電泳，行硝酸纖維膜轉膜，5%脫脂牛奶在室溫下封閉，加入一抗α-Tubulin(1 ∶2 000稀釋)、KLF4(1 ∶1 000稀釋)、Cyclin H(1 ∶2 000稀釋)、CDK7(1 ∶3 000稀釋)、N-cadherin(1 ∶2 000稀釋)和ZEB-1(1 ∶1 000稀釋)，于4 ℃下孵育24 h，加入二抗在室溫下孵育，采用ECL發光液在成像系統顯影并拍照。

2 結果

2.1 前列腺癌組織中UG0898H09的表達qRT-PCR檢測顯示UG0898H09在前列腺癌組織和對應癌旁組織中的表達量分別為1.19±0.34和4.99±0.73，UG0898H09在前列腺癌組織中的表達下調(t=47.07，P<0.01，圖1)，提示UG0898H09可能參與前列腺癌的發生、發展。

圖1 前列腺癌組織和對應癌旁組織中UG0898H09的表達：與癌旁組織相比，**P<0.01

2.2 UG0898H09在不同前列腺癌細胞株中的表達qRT-PCR檢測顯示UG0898H09在前列腺癌細胞株PC-3、LNCaP、C4-2B、PC-3M、DU-145和正常前列腺上皮細胞RWPE-1中表達量分別為0.80±0.04、0.17±0.03、0.43±0.01、0.72±0.03、0.50±0.04和1.00±0.05，UG0898H09在前列腺癌細胞株中的表達下調(P<0.05，圖2)。UG0898H09在LNCaP細胞中的表達量最低(P<0.01)，選擇LNCaP細胞進行后續實驗。

圖2 UG0898H09在正常前列腺上皮細胞和前列腺癌細胞中的表達：與RWPE-1細胞相比，*P<0.05，**P<0.01

2.3 qRT-PCR檢測轉染效率陰性對照組和UG0898H09組LNCaP細胞中UG0898H09的表達量分別為1.02±0.11和8.93 ± 0.56，差異有統計學意義(P<0.01)，提示轉染成功。

2.4 WST-1法檢測轉染后細胞增殖能力與陰性對照組比較，轉染UG0898H09后的第2天LNCaP細胞增殖能力開始下降，提示UG0898H09可抑制前列腺癌LNCaP細胞的增殖能力(P<0.05，圖3)。

圖3 WST-1法檢測各組LNCaP細胞增殖能力：與陰性對照組相比，*P<0.05，**P<0.01

2.5 細胞劃痕實驗檢測轉染后細胞遷移能力陰性對照組和UG0898H09組細胞的遷移率分別為(72.44±3.93)%和(43.83±7.11)%，差異有統計學意義(P<0.05)，UG0898H09可抑制前列腺癌LNCaP細胞的遷移能力(圖4)。

圖4 細胞劃痕實驗檢測各組LNCaP細胞遷移能力

2.6 生物信息學技術分析UG0898H09的靶基因采用生物信息學網站starBase v2.0分析，UG0898H09可互補結合miR-511-5p。采用生物信息學網站miRecords分析，miR-511-5p可互補結合KLF4 mRNA(圖5)。

圖5 生物信息學技術分析UG0898H09的靶基因

2.7 qRT-PCR檢測轉染后細胞miR-511-5p和KLF4 mRNA的表達陰性對照組和UG0898H09組LNCaP細胞中miR-511-5p的表達量分別為1.01±0.07和0.32±0.07，差異有統計學意義(P<0.01)。陰性對照組和UG0898H09組LNCaP細胞中KLF4 mRNA的表達量分別為1.01±0.10和4.71±0.84，差異有統計學意義(P<0.01)。

2.8 Western blot法檢測KLF4和細胞增殖相關蛋白表達Western blot結果顯示，與陰性對照組比較，UG0898H09組KLF4蛋白表達明顯增加，細胞增殖相關蛋白CDK7和Cyclin H表達明顯降低，細胞遷移相關蛋白N-cadherin和ZEB-1表達明顯降低(圖6)。

圖6 Western blot法檢測各組LNCaP細胞KLF4蛋白及相關蛋白的表達

3 討論

lncRNA屬于非編碼RNA家族成員，是一類長度大于200個核苷酸的轉錄本[6-7]。lncRNA參與調控染色體組裝，可在轉錄層面和轉錄后層面調控基因表達，從而影響細胞的各種生理病理過程[8-9]。已有大量研究證實lncRNA在前列腺癌中出現特異性表達，具有癌基因或抑癌基因作用，在前列腺癌發生、發展中發揮重要作用[10]。例如lncRNA CASC15、SNHG20和MIR4435-2HG在前列腺癌組織和細胞株中呈高表達，參與調控細胞的上皮-間充質轉化，可顯著促進前列腺癌細胞的遷移和侵襲[11-13]。UG0898H09是一種新發現的lncRNA，其在腫瘤特別是前列腺癌中的作用機制尚不清楚。

本實驗證實，與癌旁組織或正常前列腺上皮細胞相比，UG0898H09在前列腺癌組織和細胞中的表達顯著下調，提示UG0898H09顯著下調可能與前列腺癌的發生、發展相關。本實驗通過在LNCaP細胞中過表達UG0898H09，細胞的增殖和遷移能力均被顯著抑制，提示UG0898H09在前列腺癌細胞中起著抑癌基因作用。已有研究證實，lncRNA可通過“海綿作用”與微小RNA(miRNA)反應元件競爭性結合，抑制miRNA與靶基因信使RNA(mRNA)的結合，從而降低miRNA的RNA干擾作用，促進靶基因的表達[14]。本實驗通過生物信息學網站starBase v2.0發現，UG0898H09可配對結合miR-511-5p。有研究表明，miR-511-5p在肝癌組織和細胞株中表達顯著上調，下調miR-511-5p表達可抑制肝癌細胞的增殖，miR-511-5p發揮癌基因作用[15]。本實驗表明，過表達UG0898H09后，miR-511-5p表達降低，UG0898H09可能競爭性結合miR-511-5p。通過生物信息學網站miRecords發現，miR-511-5p可配對結合KLF4 mRNA。KLF4基因位于9q31染色體，KLF4蛋白是鋅指轉錄因子KLF家族成員，廣泛表達于人體組織，在細胞的各種生理活動中具有重要調節作用[16]。已有研究證實，KLF4蛋白在前列腺癌、乳腺癌、肺癌、結直腸癌等多種惡性腫瘤中低表達，具有抑制腫瘤細胞增殖、遷移和侵襲的作用，與腫瘤的發生、發展關系密切[17-19]。miR-511-5p表達降低后，KLF4 mRNA表達增加，表明UG0898H09可能通過吸附miR-511-5p，促進KLF4基因表達。Western blot法檢測顯示，KLF4蛋白表達上調后，細胞增殖相關蛋白CDK7和Cyclin H的表達減少，細胞遷移相關蛋白N-cadherin和ZEB-1表達減少，進一步證實前列腺癌細胞的增殖和遷移能力降低。

綜上所述，本實驗結果證實lncRNA UG0898H09在前列腺癌組織和細胞株中呈低表達，上調UG0898H09可通過miRNA海綿作用負向調控miR-511-5p表達，促進KLF4基因表達，抑制前列腺癌細胞的增殖和遷移能力。UG0898H09有望成為前列腺癌潛在的診斷標志物和治療靶點。