延胡索酸水合酶缺失型子宮平滑肌瘤3例臨床病理和分子遺傳學(xué)分析

尹曉娜，段 婷，陳 豪，何向蕾，趙 明

遺傳性平滑肌瘤病和腎細胞癌(hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma, HLRCC)綜合征是一種罕見的常染色體顯性遺傳病，其遺傳性驅(qū)動分子事件為延胡索酸水合酶(fumarate hydratase, FH)基因的雙等位基因失活。研究表明，F(xiàn)H在HLRCC綜合征中扮演的是一種腫瘤抑制基因，胚系突變表現(xiàn)為功能喪失性突變，F(xiàn)H功能喪失導(dǎo)致體內(nèi)延胡索酸的異常蓄積從而促成HLRCC綜合征的發(fā)生[1-4]。HLRCC綜合征的女性患者幾乎均有皮膚和(或)子宮的多發(fā)性平滑肌瘤，15%～20%可進一步發(fā)生一種獨特類型的高度侵襲性腎細胞癌，后者常常是導(dǎo)致患者死亡的主要原因[1-4]。因此，病理學(xué)檢查子宮平滑肌瘤對篩查可能罹患HLRCC綜合征的患者并進行密切的腎癌監(jiān)控具有重要的臨床意義。

英文文獻中對FH缺失型子宮平滑肌瘤的組織病理學(xué)分析起始于對HLRCC綜合征相關(guān)性腎細胞癌的臨床病理學(xué)特征較為充分的認識之后[5]。FH缺失型子宮平滑肌瘤較罕見，占所有子宮平滑肌瘤的0.4%～1.6%[2-4]，國內(nèi)關(guān)于其詳細形態(tài)學(xué)及分子遺傳學(xué)特征的研究報道較少[6]。本文報道3例FH缺失型子宮平滑肌瘤并結(jié)合相關(guān)文獻進行總結(jié)分析，以期提高國內(nèi)病理醫(yī)師對這一少見類型子宮平滑肌瘤的認識水平。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集2014年1月～2019年12月浙江省人民醫(yī)院(2例)和杭州市婦產(chǎn)科醫(yī)院(1例)診斷的FH缺失型子宮平滑肌瘤患者。臨床信息、影像學(xué)以及巨檢資料來自存檔紙質(zhì)和(或)電子病歷系統(tǒng)記錄，隨訪信息來自電子病歷系統(tǒng)記錄及與臨床醫(yī)師和(或)患者的電話隨訪。患者年齡分別為26、28和44歲，均無家族性腫瘤史，提示無HLRCC綜合征的典型臨床表現(xiàn)。術(shù)前超聲檢查均提示子宮多發(fā)性平滑肌瘤，3～22個，最大直徑3.0～20 cm。例1、2行肌瘤剜除術(shù)，例3行全子宮和雙側(cè)附件切除術(shù)。例1、2獲得較為長期的隨訪，患者及其直系親屬在隨訪中均未發(fā)現(xiàn)腎腫瘤，例2在術(shù)后47個月出現(xiàn)子宮腫瘤復(fù)發(fā)。

1.2 方法標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3～4 μm厚切片，HE染色，顯微鏡下觀察。免疫組化染色采用EnVision兩步法，一抗包括SMA、desmin、CD10、p16、p53以及Ki-67，均購自北京中杉金橋公司。根據(jù)抗體說明書及實驗室規(guī)范進行操作，常規(guī)設(shè)立陽性和陰性對照。FH(J-13，稀釋比1 ∶200)一抗購自美國Santa Cruz公司，F(xiàn)H表達缺失定義為腫瘤細胞完全無表達，周圍的非腫瘤性平滑肌組織和腫瘤內(nèi)血管內(nèi)皮細胞表達作為陽性內(nèi)對照。對其中2例的腫瘤和非腫瘤性石蠟包埋組織行分子遺傳學(xué)檢測，1例行高通量二代測序，另1例行FH基因的全外顯子(10個編碼外顯子)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴增和Sanger測序，操作方法根據(jù)文獻報道的方法進行[1-4]。

2 結(jié)果

2.1 眼觀例1、2為多量破碎組織，切面灰白、灰黃色，大部分區(qū)域質(zhì)軟，局灶可見漩渦狀紋理。例3可見6個結(jié)節(jié)，5個較小的結(jié)節(jié)顯示質(zhì)硬伴漩渦狀紋理，1個較大的結(jié)節(jié)(直徑3.0 cm)切面灰黃色，質(zhì)軟呈破絮狀，與周圍組織分界清，術(shù)前考慮為平滑肌肉瘤(圖1)。

①②③④⑤⑥⑦

2.2 鏡檢例2、3為非典型平滑肌腫瘤，例1為富于細胞性平滑肌瘤。3例腫瘤邊界均較清楚，呈推擠狀，低倍鏡下均可見明顯的鹿角形的薄壁擴張血管和血管外皮瘤樣結(jié)構(gòu)(圖2)，高倍鏡下瘤細胞核均可見大的嗜酸性核仁伴核仁周空暈(圖3)以及胞質(zhì)內(nèi)的圓形嗜酸性玻璃樣小球沉積(圖4)。例1和例3腫瘤高度富于細胞，例2中等富于細胞，瘤細胞核卵圓形或短梭形。例2、3可見奇異型核，表現(xiàn)為核增大而不規(guī)則、深染和多核化等(圖5)，其中例2為彌漫散在，例3為局灶聚集。例1在富于細胞的團塊中可見多灶的間質(zhì)水腫，形成肺水腫樣結(jié)構(gòu)(圖6)。例2、3可見核分裂象，分別為5、1個/10 HPF。例3局灶可見壞死。在普通型平滑肌瘤常見的間質(zhì)玻璃樣變性這一特點僅在例3局灶可見，例1、2均缺如。例3的其余5個較小的結(jié)節(jié)均表現(xiàn)為普通型子宮平滑肌(包括1例腺肌瘤)的特點。

2.3 免疫表型3例瘤細胞均顯示FH完全表達缺失，周圍的非腫瘤性平滑肌組織和腫瘤內(nèi)的血管內(nèi)皮細胞胞質(zhì)顆粒狀表達作為陽性內(nèi)對照(圖7)。例3的另5個較小的普通型平滑肌瘤FH無表達缺失。瘤細胞均彌漫表達SMA和desmin，斑駁狀表達p16，不表達CD10，p53均為野生型，Ki-67增殖指數(shù)1%～3%。

2.4 分子遺傳學(xué)特征例1行高通量二代測序示FH的5號外顯子缺失c.668_669delAA(移碼突變)，變異等位基因頻率(VAF)為84.8%，為病征特異性。例2行全外顯子Sanger測序示FH的10號外顯子點突變c.1724 T>C(錯義突變)(圖8)。2例的非腫瘤組織FH檢測均為野生型。

圖8 (例2)Sanger測序法示FH基因10號外顯子c.1724 T>C，錯義突變

3 討論

FH缺失型子宮平滑肌瘤較罕見，占所有類型子宮平滑肌瘤的0.4%～1.6%[1-4]。盡管其發(fā)病率較低，但由于子宮肌瘤的整體發(fā)病基數(shù)非常大，因此FH缺失型子宮平滑肌瘤的發(fā)病絕對數(shù)量并不少。其中位發(fā)病年齡38歲(20～87歲)，較無FH缺失病例的中位發(fā)病年齡要早6～12年[1-4]。發(fā)病越年輕的患者FH缺失型比例越高。在40歲以內(nèi)的子宮平滑肌瘤中FH缺失型占比約2.6%[1]，而在30歲以內(nèi)的子宮平滑肌瘤中FH缺失型的占比則可達4.6%[7]。在臨床上約50%病例為多發(fā)性，即多個肌瘤均為FH缺失型，更常見的情況是多個肌瘤中僅有1個或部分為FH缺失型。

FH缺失型平滑肌瘤大體上通常質(zhì)地較軟，漩渦狀結(jié)構(gòu)不明顯或缺如[3]，其鏡下也具有相對較為特征的形態(tài)學(xué)特點[1-11]。組織學(xué)上，F(xiàn)H缺失型子宮平滑肌瘤通常富于細胞，低倍鏡下可見明顯程度不等的鹿角狀血管和血管外皮瘤樣結(jié)構(gòu)，瘤細胞胞質(zhì)原纖維狀，核的束狀結(jié)構(gòu)不甚明顯，核卵圓形或短梭形，部分瘤細胞核呈鏈狀、列兵樣或柵欄狀排列。高倍鏡下瘤細胞核幾乎均可見明顯的紫紅色或嗜酸性核仁伴核仁周空暈以及胞質(zhì)內(nèi)的圓形嗜酸性玻璃樣小球沉積，前者在不同的腫瘤或同一腫瘤的不同區(qū)域表現(xiàn)的明顯程度不同。多數(shù)腫瘤顯示一定程度的核非典型性(中度為主，少數(shù)為重度)，局灶或彌漫分布，表現(xiàn)為奇異型核、多核或花環(huán)狀核伴核深染以及核內(nèi)包涵體形成等[12]，在存在非典型性核的區(qū)域更易查見大的嗜酸性核仁以及核仁周空暈。核分裂象通常小于5個/10 HPF，可見不典型核分裂象，罕見壞死。約60%的病例在瘤細胞之間可見局灶間質(zhì)水腫，水腫區(qū)周圍繞以梭形瘤細胞，類似于肺泡樣結(jié)構(gòu)[2]。總體來說，F(xiàn)H缺失型子宮平滑肌瘤在組織學(xué)亞型分類中約20%為無或僅有輕度非典型性的富于細胞性平滑肌瘤，約80%為非典型平滑肌瘤或惡性潛能未定的平滑肌腫瘤[13]，幾乎不表現(xiàn)為平滑肌肉瘤[2-4]。值得注意的是，盡管上述組織學(xué)特點對于形態(tài)學(xué)初步篩查FH缺失型子宮平滑肌瘤有一定的敏感性，但特異性并不強，比如明顯的嗜酸性核仁伴核仁周空暈、嗜酸性玻璃樣小球以及鹿角狀血管等分別可在約69%、19%和39%的無FH缺失的子宮平滑肌瘤中出現(xiàn)[3]。

FH無論是胚系突變還是體細胞突變均為功能喪失性突變，其中以錯義突變最常見，熱點區(qū)為4～7號外顯子[1-5,7-11]。與HLRCC綜合征相關(guān)的子宮平滑肌瘤中FH胚系突變典型的表現(xiàn)為“雙打擊”事件，即存在1個胚系突變的等位基因同時伴有另一個等位基因的體細胞突變，因此FH另一等位基因的體細胞突變是綜合征患者形成子宮平滑肌瘤的遺傳學(xué)基礎(chǔ)[1-2]。FH功能喪失性突變可造成FH蛋白表達缺失，造成體內(nèi)延胡素酸的蓄積，琥珀酸酯化最終形成2-琥珀酸半胱氨酸(2SC)[1,9]。因此FH蛋白表達缺失與2SC過表達可作為診斷和篩查FH缺失型子宮平滑肌瘤的免疫組化標(biāo)志物。文獻中對FH蛋白表達缺失與FH基因突變(無論體細胞還是胚系突變)之間的相關(guān)性報道差異較大，從50%～100%不等，這可能與FH的突變復(fù)雜性以及分子遺傳學(xué)檢測手段的敏感性有關(guān)[1-3,7]。另外，無論是胚系還是體細胞突變，F(xiàn)H突變并不必然意味著FH表達缺失，部分FH錯義突變的腫瘤可無FH蛋白表達缺失。FH免疫組化表達缺失對于識別FH突變(無論體細胞還是胚系突變)的子宮平滑肌瘤的敏感性不強，僅依靠FH免疫組化表達缺失，可能會遺漏掉一部分存在FH突變的腫瘤，以及潛在的HLRCC綜合征患者。2SC蛋白過表達相比較于FH蛋白表達缺失對于識別FH突變的子宮平滑肌腫瘤可能更具敏感性[1,9]。但遺憾的是，目前并無商品化的2SC抗體，因此限制了其廣泛使用。

多項前瞻性和回顧性的大樣本分析表明，對臨床診斷的所有子宮平滑肌瘤行FH免疫組化染色缺失來篩查FH突變，絕大多數(shù)FH缺失型平滑肌瘤為FH體細胞突變型[1-4]，胚系突變型/HLRCC綜合征相關(guān)性的病例非常罕見。FH體細胞和胚系突變相關(guān)的子宮平滑肌瘤具有相似的特征性的組織形態(tài)學(xué)特點，相比較來說，應(yīng)用FH缺失相關(guān)的形態(tài)學(xué)特點比FH缺失的免疫組化染色對于篩查FH突變的敏感性更強[1,10-11]。由于目前尚無商品化的2SC抗體，F(xiàn)H的免疫組化染色篩查仍具有一定的價值。如上所述，盡管大多數(shù)FH突變的子宮平滑肌瘤為體細胞突變型，但在年輕患者中(特別是30歲以下)FH胚系突變的比例相對較高[7]，因此對于這部分患者應(yīng)該給予重點關(guān)注，警惕HLRCC綜合征的可能。盡管存在組織學(xué)的非典型性，但長期的隨訪證據(jù)表明FH缺失型子宮平滑肌瘤(無論是否與HLRCC綜合征相關(guān))本身不具有侵襲性和轉(zhuǎn)移潛能[3,7]，核分裂象通常小于5個/10 HPF，可見不典型核分裂象，但罕見壞死，目前尚無明確的FH缺失型平滑肌肉瘤的報道[2-4]。由于許多患者較年輕且肌瘤常為多發(fā)，同時伴有較嚴(yán)重的臨床癥狀，因而需要進行早期的肌瘤切除術(shù)，部分腫瘤可能需要多次行肌瘤切除并最終行子宮切除[3,7]。

綜上所述，F(xiàn)H缺失型子宮平滑肌瘤具有其獨特的形態(tài)學(xué)特點，組織學(xué)上常表現(xiàn)為非典型平滑肌瘤，遺傳學(xué)上FH基因的體細胞突變較胚系突變多見。聯(lián)合特征性的組織學(xué)表現(xiàn)以及FH免疫組化染色有助于臨床對HLRCC綜合征的篩查，但確診需要結(jié)合典型的臨床表現(xiàn)以及FH基因的胚系突變檢測。病理學(xué)檢查子宮平滑肌瘤對篩查可能罹患HLRCC綜合征的患者并進行密切的腎癌監(jiān)控具有重要的臨床意義。