乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中PTEN、EZH2和VEGF的表達(dá)及意義

徐小艷，王建君，徐憲偉，馮智坤，門穎麗，楊金花

侵襲和轉(zhuǎn)移是乳腺癌患者死亡的主要原因，乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移的發(fā)生機(jī)制復(fù)雜，其過程涉及眾多癌基因和抑癌基因參與。PTEN被認(rèn)為是一種與腫瘤發(fā)生關(guān)系密切的抑癌基因，其在正常組織中高表達(dá)，在腫瘤中低表達(dá)或不表達(dá)。EZH2具有組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的活性，在多種惡性實(shí)體腫瘤中高表達(dá)，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中的重要促癌基因。VEGF是腫瘤血管生成過程中作用最強(qiáng)、特異性最高的促血管生長因子，與腫瘤的浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前，PTEN和EZH2在乳腺癌中單獨(dú)報道較多見，PTEN和EZH2的相關(guān)性研究在膀胱癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等腫瘤中已有報道，但兩者在乳腺癌中的相關(guān)性尚未見報道。乳腺癌中PTEN和EZH2表達(dá)與VEGF是否存在相關(guān)性？由于浸潤性導(dǎo)管癌占乳腺癌的大部分，因此本實(shí)驗采用免疫組化SP法檢測96例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中PTEN、EZH2和VEGF蛋白的表達(dá)，分析PTEN、EZH2和VEGF蛋白與臨床病理特征的關(guān)系及三者的相關(guān)性，豐富和拓展對乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的認(rèn)識，以期為乳腺癌的治療和預(yù)后提供新的策略。

1 材料與方法

1.1 臨床資料收集鄭州人民醫(yī)院2013年1月～2015年12月存檔的96例乳腺原發(fā)浸潤性導(dǎo)管癌病理活檢標(biāo)本及對應(yīng)癌旁組織(距離腫塊約3 cm)，鏡下為正常乳腺組織或良性增生性病變。96例乳腺原發(fā)浸潤性導(dǎo)管癌患者術(shù)前均未接受放、化療。收集患者相關(guān)臨床病理資料，按照WHO(2012)乳腺腫瘤病理分級對其進(jìn)行分組。根據(jù)ER、PR、HER-2、CK5/6和EGFR的表達(dá)，按照第12屆St.Gallen專家共識的乳腺癌分子分型標(biāo)準(zhǔn)：Luminal A型30例，Luminal B型32例，HER-2過表達(dá)型24例，基底樣型10例。所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋，并經(jīng)鄭州人民醫(yī)院病理科確診。

1.2 主要試劑PTEN、EZH2和VEGF一抗兔抗人單克隆抗體(即用型)、二抗及DAB，均購自福州邁新公司。

1.3 免疫組化免疫組化染色采用SP法：石蠟組織切片、烤片、脫蠟并水化；抗原修復(fù)；一抗37 ℃孵育2 h；二抗37 ℃孵育20～30 min；DAB顯色5～10 min；脫水、透明和封固。用已知PTEN、EZH2和VEGF陽性的乳腺癌組織和PBS分別代替一抗作為陽性和空白對照。

1.4 結(jié)果判斷免疫組化判讀由兩位高年資病理醫(yī)師采用雙盲法進(jìn)行判讀。根據(jù)染色強(qiáng)度和染色細(xì)胞所占百分比進(jìn)行半定量判定，其中染色強(qiáng)度分為：陰性(-)，弱陽性(+)，中等陽性()，強(qiáng)陽性()四個等級。染色百分比分為<30%，≥30%且<50%，≥50%。低表達(dá)包括陰性(-)、弱陽性(+，無論細(xì)胞著色范圍)、中等陽性(，細(xì)胞著色范圍<30%)；高表達(dá)包括：中等陽性(，細(xì)胞著色范圍≥30%)、強(qiáng)陽性(，無論細(xì)胞著色范圍)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，PTEN、EZH2和VEGF表達(dá)和臨床病理參數(shù)的關(guān)系采用χ2檢驗，采用Spearman進(jìn)行相關(guān)性分析，檢驗水準(zhǔn)α=0.05，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌及癌旁組織中PTEN、EZH2和VEGF的表達(dá)PTEN主要定位于細(xì)胞質(zhì)，96例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中PTEN的陽性率明顯低于乳腺癌旁組織(P<0.001)。EZH2主要定位于細(xì)胞核，96例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中EZH2陽性率明顯高于乳腺癌旁組織(P<0.001)。VEGF主要定位于細(xì)胞質(zhì)，96例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中VEGF陽性率明顯高于乳腺癌旁組織(P<0.001，表1，圖1)。

ABCDEF

表1 乳腺癌和癌旁組織中PTEN、EZH2和VEGF的表達(dá)[n(%)]

2.2 乳腺癌中PTEN、EZH2和VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系96例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中，PTEN、EZH2和VEGF表達(dá)均與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期均有關(guān)(P均<0.05)。此外，VEGF與患者年齡有關(guān)，其在年齡<50歲組的陽性率較高(P<0.05，表2)。

表2 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中PTEN、EZH2和VEGF表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PTEN、EZH2和VEGF表達(dá)的相關(guān)性96例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中，PTEN和EZH2同時高表達(dá)者27例，同時低表達(dá)者8例，僅PTEN高表達(dá)者30例，僅EZH2高表達(dá)者31例，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：PTEN與EZH2表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.323，P<0.001)。PTEN和VEGF同時高表達(dá)者30例，同時低表達(dá)者5例，僅PTEN高表達(dá)者27例，僅VEGF高表達(dá)者34例，Spearman相關(guān)性分析結(jié)果顯示：PTEN與VEGF表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(rs=-0.360，P<0.001，表3)。

表3 乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中PTEN、EZH2和VEGF表達(dá)的相關(guān)性

2.4 PTEN、EZH2和VEGF表達(dá)與乳腺癌分子亞型的關(guān)系PTEN表達(dá)與乳腺癌分子亞型有關(guān)，其在Luminal A和Luminal B型乳腺癌中有較高的陽性率(分別為22/30，26/32)，在HER-2過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌中陽性率較低(分別為6/24、3/10)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=24.106，P<0.001)；EZH2蛋白在HER-2過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌中陽性率較高(分別22/24、8/10)，在Luminal A和Luminal B型中陽性率較低(10/30、18/32)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=20.838，P<0.001)；VEGF蛋白在HER-2過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌中陽性率較高(分別為21/24、8/10)，在Luminal A和Luminal B型中陽性率較低(12/30、22/32)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=14.878，P=0.002)。PTEN、EZH2和VEGF在Luminal A和Luminal B型中的陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，PTEN、EZH2和VEGF在HER-2過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌中的陽性率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05，表4)。

表4 PTEN、EZH2和VEGF表達(dá)與乳腺癌分子分型的關(guān)系

3 討論

隨著對腫瘤基因研究的不斷深入，人們對乳腺癌的發(fā)病機(jī)制有了進(jìn)一步的認(rèn)識，乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后并不是單個分子事件，而是涉及多個促癌基因和抑癌基因異常表達(dá)，如HER-2、p53等基因[1-2]。PTEN、EZH2和VEGF作為調(diào)控細(xì)胞生長、凋亡、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因，大量研究表明其與腫瘤浸潤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。

PTEN基因作為一種抑癌基因，能夠負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞生長，誘導(dǎo)凋亡并抑制細(xì)胞浸潤、轉(zhuǎn)移。其在乳腺癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)存在基因突變。本實(shí)驗中PTEN蛋白在乳腺癌旁組織中陽性率低于乳腺癌組織，其表達(dá)與分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及TNM分期有關(guān)，PTEN表達(dá)在預(yù)后較好的Luminal A和Luminal B型乳腺癌中有較高的表達(dá)，表明PTEN表達(dá)能夠在一定程度上反應(yīng)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，與李新軍等[3]報道的結(jié)果一致。

EZH2作為一種癌基因，與腫瘤浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)。國外有研究發(fā)現(xiàn)EZH2在正常乳腺上皮細(xì)胞表達(dá)缺失，在乳腺導(dǎo)管原位癌中表達(dá)開始增加，其在浸潤性導(dǎo)管癌中表達(dá)明顯增加[4]。Inari等[5]的研究顯示乳腺癌組織標(biāo)本中EZH2陽性率56.3%，本組96例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織中EZH2陽性率為83.33%，明顯高于以往文獻(xiàn)報道。原因可能如下：(1)樣本含量不同；(2)采用的標(biāo)本組織學(xué)類型不同，以往研究的乳腺癌組織學(xué)類型多樣包括浸潤性導(dǎo)管癌、浸潤性小葉癌，而本實(shí)驗只涉及乳腺浸潤性導(dǎo)管癌。本組實(shí)驗發(fā)現(xiàn)有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、低分化及pTNM分期越高者，EZH2表達(dá)增加；EZH2表達(dá)在HER-2過表達(dá)型和基底樣型乳腺癌中表達(dá)較高，提示EZH2高表達(dá)在一定程度上反應(yīng)了乳腺癌發(fā)生、發(fā)展。

腫瘤的生長、浸潤和轉(zhuǎn)移離不開新生毛細(xì)血管的形成。VEGF能夠作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)細(xì)胞分裂和毛細(xì)血管出芽生長，為腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移提供相對有利的微環(huán)境[6-7]。本實(shí)驗結(jié)果顯示，VEGF與乳腺浸潤性導(dǎo)管癌組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、pTNM分期均有關(guān)，提示VEGF高表達(dá)促進(jìn)了乳腺癌浸潤和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗VEGF在乳腺癌中的表達(dá)與以往文獻(xiàn)報道基本一致，有所不同的是本實(shí)驗中VEGF與腫瘤患者的年齡相關(guān)，其在年齡<50歲組的陽性率較高，推測年輕患者機(jī)體代謝旺盛，其腫瘤組織中VEGF表達(dá)較高，可以作為后續(xù)分析的切入點(diǎn)。

PTEN和EZH2在前列腺癌、結(jié)腸癌等中表達(dá)的相關(guān)性已有文獻(xiàn)報道[8-9]，兩者均呈負(fù)相關(guān)，但兩者在乳腺癌中的相關(guān)性研究尚未見同類報道。本實(shí)驗中相關(guān)分析結(jié)果顯示，96例乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中PTEN和EZH2呈負(fù)相關(guān)，研究結(jié)果還表明乳腺癌中PTEN和VEGF呈負(fù)相關(guān)。眾多研究表明，抑癌基因的抑癌作用以及癌基因的致癌作用不僅僅是某個基因的行為，而是多個基因表達(dá)共同協(xié)作的結(jié)果。通過查閱文獻(xiàn)，我們得知PTEN蛋白表達(dá)降低可使細(xì)胞間的黏附力下降，上調(diào)MMP和VEGF的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤以及腫瘤血管形成[10]。EZH2高表達(dá)則能夠上調(diào)MMP和VEGF的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的浸潤、轉(zhuǎn)移和腫瘤血管的形成[11-12]。進(jìn)一步文獻(xiàn)研究表明，PTEN可以通過抑制MAPK/ERK信號通路來發(fā)揮腫瘤抑制作用[13]，EZH2則可以通過激活MAPK/ERK信號通路促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14]。根據(jù)本實(shí)驗結(jié)果顯示，推測在乳腺癌中PTEN失表達(dá)和EZH2過表達(dá)可能會導(dǎo)致MAPK/ERK信號通路顯著激活，上調(diào)VEGF的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。本實(shí)驗不足之處在于僅從蛋白水平分析了三者的相關(guān)性，其具體分子作用機(jī)制有待進(jìn)一步分析。

綜上所述，PTEN蛋白在乳腺良性增生性病變及正常組織中高表達(dá)，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中低表達(dá)，其低表達(dá)提示組織學(xué)分化差及淋巴結(jié)易轉(zhuǎn)移，其在Luminal A和Luminal B型中有較高的表達(dá)。EZH2和VEGF蛋白在乳腺良性增生性病變及正常組織中幾乎不表達(dá)，乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中高表達(dá)，蛋白水平表達(dá)越高，組織學(xué)分化越差，腫瘤分期越高，淋巴結(jié)容易轉(zhuǎn)移，其在HER-2過表達(dá)型和基底樣型中表達(dá)較高。乳腺浸潤性導(dǎo)管癌中PTEN蛋白和EZH2及VEGF蛋白呈負(fù)相關(guān)，三者可能通過相同的信號通路共同作用，促進(jìn)了乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展，其分子機(jī)制有待進(jìn)一步分析。