熒光定量PCR與抗酸特殊染色對疑似骨關節結核中結核分枝桿菌的檢測對比

孫林雍，嚴嘉琦，陳 昶，陳 昱，鄒 艷，陳 杰，唐 源

結核病是由結核分枝桿菌(mycobacterium tuberculosis, MTB)感染引起的慢性傳染性疾病，病原菌為MTB復合群，包括：結核分枝桿菌、牛分枝桿菌、非洲分枝桿菌、田鼠分枝桿菌等[1]，可侵犯人體全身各種器官，以肺部最常見。骨關節結核是一種罕見的肺外結核病，早期癥狀不明顯，近年來發病率呈上升趨勢，尤其在不發達國家。我國是全球22個結核病高負擔國之一，患病人數位居世界第2[2]，因此結核病成為制約我國社會經濟發展的重大公共問題之一[3]。骨關節結核病灶中結核分枝桿菌比肺結核病灶中少，增加了早期診斷的難度。且此類結核通常進程緩慢，早期正確診斷和盡早適當治療對骨關節結核的預后至關重要。本實驗同時行實時熒光定量PCR(real time PCR, RT-PCR)及抗酸染色檢測，并與臨床診斷結果進行比較，分析兩種檢測方法的靈敏度、特異性差異，以及MTB檢出率與臨床診斷符合率的一致性。

1 材料與方法

1.1 一般資料選取四川大學華西醫院2017年1月～2018年1月臨床送檢疑似骨關節結核樣本253例。所有樣本均經石蠟包埋組織切片，鏡下形態學以肉芽腫性炎伴壞死部分區域可見鈣化為主要組織學改變(圖1)；對所有標本同時行RT-PCR及抗酸染色檢測。

①②

1.2 儀器與試劑QIAamp DNA Tissue Kit(Cat.56404)、MTB核酸檢測試劑盒(凱杰生物公司)、組織切片抗酸染色試劑盒(Ventana AFB Ⅲ Staining Kit，Roche公司)、Qiacube全自動組織處理機(Qiagen公司)、CFX-96 real-time PCR儀(Bio-Rad公司)、BenchMark全自動特殊染色機(羅氏診斷產品上海公司)。

1.3 方法

1.3.1DNA提取 取石蠟包埋組織切成5 μm厚切片3～5張裝入EP管中用于DNA提取。操作步驟按照QIAamp(Cat.56404)DNA FFPE Tissue Kit(50 T)試劑盒說明書進行。

1.3.2抗酸染色 將石蠟包埋組織5 μm厚切片，裱片，烤片，打印相應條碼貼于載玻片一側，將玻片放置于BenchMark全自動特殊染色機，選擇抗酸染色程序，進行自動染色，染色結束后封固蓋玻片。

1.3.3RT-PCR 按產品說明配置反應體系，除待測樣本外，同時進行陰性、陽性對照實驗,陰、陽對照為試劑盒自帶。將PCR反應管放入CFX-96 real-time PCR檢測分析儀。PCR反應條件：37 ℃ 5 min，94 ℃ 1 min，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，同時實施信號采集，返回第三步循環41次，結束反應。

1.3.4結果判讀 抗酸染色切片油鏡下見棕紅色兩端鈍圓稍彎曲的細絲狀桿菌判定為陽性，否則為陰性。RT-PCR按MTB核酸檢測試劑盒產品說明，陰性對照Ct值=0，陽性對照Ct值<25，檢測樣本Ct值=0或>37判定為陰性，Ct值≤37判定為陽性。本實驗將臨床資料(結核菌素實驗、結核菌培養等)綜合診斷并經抗結核治療的病例歸類為結核，臨床資料未診斷為結核的病例歸類為非結核。

1.4 統計學方法各組檢測結果采用SPSS 19.0軟件進行統計學分析，兩組間比較采用四格表χ2檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 臨床特征253例樣本中，男性127例，占50.2%，女性126例，占49.8%，男女比約1 ∶1。患者年齡1～82歲,中位年齡44歲。病變部位：脊椎139例、膝關節34例、髖關節22例、肋骨14例、腕關節9例、其他35例。

2.2 RT-PCR及抗酸染色檢測結果與臨床結果比較253例樣本中，總檢出率為45.8%(116/253)；其中，RT-PCR檢出率為38.3%(97/253)，抗酸染色檢出率為41.5%(105/253)，兩種檢測的符合率為88.1%(223/253)(表1，圖2、3)。在116例陽性病例中，僅RT-PCR檢測陽性11例，臨床確診9例，臨床符合率為81.8%(9/11)；僅抗酸染色檢測陽性19例，臨床確診5例，臨床符合率為26.3%(5/19)；兩種檢測均陽性86例，臨床確診80例，臨床符合率為93.0%(80/86)。兩種檢測均陽性比僅抗酸染色陽性與臨床結果符合率的差異有統計學意義(χ2=44.910，P<0.001)；僅RT-PCR陽性比僅抗酸染色陽性與臨床結果符合率的差異有統計學意義(χ2=8.623，P=0.003)；僅RT-PCR陽性比兩種檢測均陽性與臨床符合率的差異無統計學意義(χ2=1.618，P=0.203)。本組樣本中脫鈣組織5例，其中3例臨床確診為結核病，2例臨床確診為非結核病。

表1 RT-PCR和抗酸染色法檢測結果比較

圖3 實時熒光定量PCR結果陽性，擴增曲線升起，CT值<37，陰、陽對照正常

2.3 靈敏度及特異性99例臨床確診為結核病樣本中，RT-PCR檢測89例陽性，10例陰性，靈敏度為89.9%(89/99)；抗酸染色檢測85例陽性，14例陰性，靈敏度為85.9%(85/99)。154例臨床確診為非結核病樣本中，RT-PCR檢測8例陽性，146例陰性，特異性為94.8%(146/154)；抗酸染色檢測20例陽性，134例陰性，特異性為87.0%(134/154)(表2)。

表2 RT-PCR和抗酸染色法檢測骨關節組織中結核分枝桿菌的靈敏度和特異性比較

3 討論

本實驗中RT-PCR檢出率為38.3%(97/253)，抗酸染色檢出率為41.5%(105/253)。國內關于結核桿菌檢出的報道中，姚梅宏等[4]對40例確診結核病的石蠟包埋組織樣本進行MTB檢測，PCR及抗酸染色法的檢出率分別為80%(32/40)、50%(20/40)，均高于本實驗結果。本組為可疑骨關節結核病的石蠟包埋組織樣本，報道選取確診結核病的不限于骨關節的石蠟包埋組織樣本。分析原因可能與樣本選取有關。吳啟秋等[5]對250例復治骨關節結核病經BACTEC法初代分離培養進行檢測，檢出率為18.4%(46/250)，明顯低于本實驗中骨關節結核病RT-PCR的檢出率，其原因可能與檢測方法及研究樣本制備方法不同有關。李小燕等[6]對110例石蠟包埋組織樣本行RT-PCR及抗酸染色檢測，檢出率分別為36.4%(40/110)、17.3%(19/110)。其RT-PCR的檢出率與本實驗結果基本一致，但抗酸染色的檢出率明顯低于本組結果，其原因可能與不同實驗室抗酸染色質量、診斷醫師鏡下觀察經驗有關。

國內一組研究報道[7]不限于骨結核的肉芽腫性炎伴壞死，RT-PCR的檢出率高于抗酸染色，而本組中RT-PCR的檢出率略低于抗酸染色。分析原因可能與活檢小標本組織過小，導致PCR檢測組織中沒有病變組織；以及骨組織、脫鈣組織對PCR擴增的影響有關。本組兩種檢測的符合率為88.1%，林曉[8]對118例疑似結核病樣本進行檢測，兩種檢測的符合率為95.76%。分析本組病例符合率低于報道的原因，可能與選取樣本及樣本量有關。

本組19例抗酸染色陽性而RT-PCR檢測陰性病例中，臨床確診為MTB(5例)的數量低于為非MTB(14例)。其原因可能與我院地處西南，病例構成來自多民族地區且人員流動復雜，容易造成其他抗酸陽性分枝桿菌感染有關。11例僅RT-PCR陽性病例中，臨床確診為MTB 9例、非MTB 2例。86例抗酸染色與RT-PCR均陽性病例中，臨床確診為MTB 80例、非MTB 6例。其中臨床確診為非MTB(8例)的病例均未經抗結核治療，分析原因可能與骨關節結核發展緩慢，臨床特征不明顯有關。由于RT-PCR為結核病的特異性檢測，因此當RT-PCR檢測陽性臨床診斷為非MTB時建議患者隨訪。本組樣本中脫鈣組織5例，臨床確診為結核病3例，其中2例抗酸染色及RT-PCR檢測均為陰性；1例抗酸染色陽性，RT-PCR檢測陰性。臨床確診為非結核病2例，抗酸染色及RT-PCR檢測均為陰性。說明脫鈣組織可能對抗酸染色及PCR擴增有影響。

本實驗中RT-PCR檢測試劑盒采用一對PCR引物和一個熒光雙標記探針，中期擴增片段為IS6110，特異性通過了NMPA認證，檢測靈敏度為每毫升10個MTB即可檢出。盡管全自動抗酸染色與手工染色比較，染色條件恒定不受外界環境變化的影響，但由于抗酸染色陽性包括了MTB復合群、麻風分枝桿菌和非結核分枝桿菌，不能區分MTB與非MTB，并受觀察者主觀因素影響，易造成漏、誤診[9]。因此，同時行RT-PCR及抗酸染色檢測可以提高診斷結核病的準確性。

綜上所述，本實驗對比了疑似骨關節結核石蠟包埋組織RT-PCR和抗酸染色結果與臨床結果發現，僅抗酸染色陽性時，因不能排除其他分枝桿菌感染，建議結合臨床考慮；當RT-PCR檢測陽性臨床診斷為非MTB時，建議患者隨訪。