脂蛋白腎病腎臟組織油紅O染色方法改良

馬依依，屈 磊，張 帆，喻小娟，王素霞，楊 莉

脂蛋白腎病是一種罕見的由ApoE基因突變引起的常染色體隱性遺傳疾病。ApoE為低密度脂蛋白受體，其突變不僅可引起血清中β脂蛋白前體、β脂蛋白和ApoE升高，還可導致Ⅲ型高脂血癥，而Ⅲ型高脂血癥患者的腎小球損傷病理改變與脂蛋白腎病相同[1-2]。該病突出表現為腎小球毛細血管腔內脂質沉積，腎小球毛細血管腔內的脂蛋白栓在經10%中性福爾馬林固定、石蠟切片，僅在PAS染色下有淡染色，確診脂蛋白腎病需冷凍組織油紅O或蘇丹紅染色陽性，該陽性物質為脂蛋白[3-4]。因此，針對脂蛋白栓的染色在診斷脂蛋白腎病中非常重要。本實驗通過對比三種不同油紅O染色方法(粉末油紅O、經60%異丙醇處理的粉末油紅O、改良版油紅O)，探索脂蛋白腎病患者腎組織油紅O染色的較優染色方法，為臨床病理診斷提供快速且準確的病理技術服務。

1 材料與方法

1.1 標本選取2018～2019年北京大學第一醫院腎內科臨床病理確診的2例脂蛋白腎病。腎穿刺活檢冷凍組織5 μm厚切片。

1.2 配制試劑油紅O染液：0.05 g油紅O粉末(Sigma Aldrich)室溫溶于100 mL 50%乙醇，過濾。改良油紅O染液：按照試劑盒說明書將Oil red O stain A與Oil red O stain B(Solarbio)以3 ∶2比例混合均勻，室溫靜置10 min。

1.3 方法

1.3.1油紅O染色法 (1)將冷凍切片取出室溫放置20 min。(2)將恢復至室溫的冷凍切片浸入配制的油紅O染液中浸染15 min。(3)去離子水終止反應。(4)滴加蘇木精至完全覆蓋腎組織，滴染2 min。(5)去離子水洗。(6)浸入1%碳酸鋰5 s進行返藍。(7)甘油封片，光鏡下觀察。

1.3.2經60%異丙醇處理的油紅O染色法 (1)將冷凍切片取出室溫放置20 min。(2)將恢復室溫的冷凍切片浸入60%異丙醇20～30 s進行預處理。(3)預處理后，直接將冷凍切片浸入事先配置好的油紅O染液中浸染15 min。(4)插入60%異丙醇中洗去浮色。(5)滴染蘇木精2 min。(6)去離子水中浸洗多余浮色。(7)浸入1%碳酸鋰5 s進行返藍。(8)甘油封片，光鏡下觀察。

1.3.3改良油紅O染色法 (1)將冷凍切片取出室溫放置20 min。(2)將恢復至室溫的冷凍切片浸入60%異丙醇20～30 s進行預處理。(3)預處理后，直接將冷凍切片浸入事先配制好的改良油紅O染液中，密閉染色15 min。(4)將冷凍切片浸入60%異丙醇中洗去浮色。(5)浸入去離子水中洗去異丙醇。(6)滴染蘇木精2 min。(7)去離子水中浸洗多余浮色。(8)浸入1%碳酸鋰返藍5 s。(9)甘油封片，光鏡觀察。

2 結果

油紅O染色結果顯示：腎小球毛細血管腔內、系膜區可見淡染橙紅色的脂滴(圖1A)。經60%異丙醇處理油紅O染色結果顯示：腎小球毛細血管腔內、系膜區可見淺染橘色的脂滴，細胞核呈淡藍色，輪廓較粉末油紅O清晰(圖1B)。改良油紅O染色結果顯示：腎小球毛細血管腔內、系膜區和部分腎小管上皮細胞胞質內可見深染紅色的脂滴，明顯區別于呈淡染的藍色細胞核，且邊界清晰(圖1C)。

ABC圖1 A.油紅O染色;B.經60%異丙醇處理的油紅O染色;C.改良油紅O染色

3 討論

脂蛋白腎病患者主要為亞裔人群(中國人、日本人)[5]，男性多于女性，男 ∶女為1.5 ∶1；主要見于成人，診斷時中位年齡31.5歲，但兒童也可見[6]；臨床主要表現為蛋白尿，可出現腎病綜合征，并呈激素抵抗。其病理改變主要為光鏡下腎小球毛細血管腔內脂質沉積、系膜細胞和基質增生，可出現系膜溶解，毛細血管壁增厚、斷裂。福爾馬林固定組織制備的石蠟切片在光鏡下僅可見毛細血管腔內淡染“血栓”，其原因為石蠟切片經二甲苯和無水乙醇浸泡后脂質已溶解消失。因此，確診脂蛋白腎病需在冷凍切片上顯示毛細血管腔內脂滴。具體方法有油紅O、尼羅紅、蘇丹紅、鋨酸染色；其中油紅O與脂質的親和力較強、著色較深，顯示脂滴位置清晰，與組織背景區分明確，油紅O染色比其他染色方法穩定、操作簡單、可重復性強[6-10]，因此臨床最常用油紅O染色幫助診斷脂蛋白腎病。

冷凍切片用于免疫組化染色通常厚度為2～3 μm，本實驗油紅O染色腎組織冷凍切片厚度為5 μm，目的是盡可能多地獲取脂質，染色效果更明顯，形態更清晰。本實驗三種油紅O染色方法皆可用于脂蛋白腎病的診斷，但在染色效果上有所差異。與油紅O染液相比，改良油紅O染液與經60%異丙醇處理油紅O染液兩種染色腎組織中脂滴位置明確、輪廓清晰，未見明顯移位，腎臟組織細胞核顏色鮮艷且輪廓清晰，并且切片背景更干凈，無明顯的橙黃色背景。油紅O染液脂滴位置相對明確，但有明顯移位且界限不清，細胞核顏色暗淡且輪廓模糊，組織背景較高且顏色偏橙黃色。其效果存在差異的原因可能與60%異丙醇預處理有關，異丙醇除起到固定脂質的作用外，還可消除非特異染色背景。

三種染色方法對于脂滴的著色程度也有明顯不同，改良油紅O染色脂滴呈鮮艷的紅色，油紅O染色脂滴呈橙色，經60%異丙醇處理油紅O染色則為淡染的橘色。原因可能為經60%異丙醇處理油紅O染液中的異丙醇溶解組織中部分脂肪、沉積量減少有關。改良油紅O染色雖然也經60%異丙醇處理，組織中脂肪雖部分溶解，但改良油紅O染液中可能含有與異丙醇高度親和的成分，從而使經過異丙醇預處理的脂質呈鮮艷的紅色。

綜上所述，對于腎臟冷凍組織，改良油紅O染液染色方法明顯優于油紅O染液和經60%異丙醇處理的油紅O染液，其原因可能與冷凍組織是否經過60%異丙醇預處理以及染液中是否含有與異丙醇高度親和的成分有關。改良油紅O染液染色方法穩定性高，操作簡單，染色鮮艷清晰，非特異性背景低，為脂蛋白腎病的病理診斷提供了穩定且可靠的染色技術。