miR-126在自發性高血壓大鼠的表達及其與血管重構的關系

李先芳 林 璋

福建省老年醫院心血管內科，福建福州 350000

血管重構是高血壓最主要的病理生理改變，也是高血壓損害靶器官的結構基礎[1-2]。文獻表明原發性高血壓患者的頸動脈發生明顯病理改變，主要表現為血管直徑和內膜中層厚度明顯增加，這種病理改變即為頸動脈血管重構[3-5]。Ⅰ型膠原蛋白（collagenⅠ，ColⅠ)和Ⅲ型膠原蛋白(collagenⅢ，ColⅢ)是細胞外基質的主要成分，兩者的表達水平一定程度上可以反映血管壁重構的程度[6]。研究表明，基因突變、內皮功能損傷和炎癥反應均可能導致血管重構的發生[7]，但是其具體機制尚未清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是單鏈非編碼的高度保守型小分子RNA，對基因起著負調控的作用。文獻表明miRNA在心血管疾病包括高血壓的發生和發展中扮演著重要作用[8]。研究發現，miR-126高表達于血管內皮細胞，參與維持血管正常內皮功能，對血管生成具有調控作用[9]。本研究旨在通過檢測miR-126在自發性高血壓大鼠中頸動脈的表達，探討其在高血壓頸動脈血管重構中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要試劑

實驗動物：20周齡的雄性SHR大鼠和WKY大鼠各12只，體重（200±10）g，動物購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證編號：SCXK（湘）2010-000。SHR大鼠為實驗組，WKY大鼠為對照組。

實驗儀器：XR900無創大鼠血壓心率測定儀（上海欣軟信息科技有限公司），Thermo Veriti7500實時熒光定量PCR儀，Alpha-1860S紫外可見分光光度計。

實驗試劑：Trizol 試劑（Invitrogen)，RT-PCR 試劑盒（Invitrogen）。RT-PCR引物序列見表1。

表1 RT-PCR引物序列

1.2 血壓測量

兩組大鼠培養條件為：12h日夜交替、（24±2）℃和相對濕度60%，從20周齡培養至34周齡，期間每隔2周進行血壓測量，使用無創大鼠血壓心率測定儀測量大鼠尾部動脈收縮壓，每次重復測量3次，取3次的平均值為最終結果。

1.3 小鼠頸動脈RNA提取及RT-PCR檢測

于34周，處死小鼠并取其頸動脈組織。然后將頸動脈組織至于液氮中保存。從液氮保存的組織中取5mg頸動脈組織，Trizol試劑盒提取總RNA，然后逆轉錄合成cDNA，根據RT-PCR試劑盒說明書和前期文獻描述步驟[10]，利用RT-PCR檢測頸動脈 Col Ⅰ、Col Ⅲ和 miR-126的表達。以 β-actin為對照，采用 2－ΔΔCt方法分析 Col Ⅰ、Col Ⅲ和miR-126的相對表達量。

1.4 統計學方法

采用SPSS19.0統計學軟件對數據進行分析，采用t檢驗對兩組數據進行統計學分析；采用Pearson方法分析miR-126與血管重構的相關性，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組收縮壓比較

觀察組大鼠從20～34周期間收縮壓均高于140mm Hg，為高血壓，對照組大鼠20～34周期間收縮壓均低于140mm Hg，血壓正常。觀察組收縮壓顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見表2。

2.2 血管結構觀察

與對照組比較，觀察組大鼠頸動脈血管腔徑顯著小于對照組，觀察組中膜厚度、中膜橫截面積、中膜厚度/腔徑顯著大于對照組，差異均有統計學意義（P＜ 0.05），見表 3。

2.3 頸動脈Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白的表達

頸動脈Col Ⅰ和Col Ⅲ的表達水平一定程度上可以反映頸動脈重構程度。利用RT-PCR技術檢測對照組和觀察組勁動脈Col Ⅰ和Col Ⅲ的表達，結果顯示觀察組Col Ⅰ和Col Ⅲ均顯著高于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖1。

表2 兩組大鼠收縮壓比較

表2 兩組大鼠收縮壓比較

組別 20周 22周 24周 26周 28周 30周 32周 34周觀察組 166.51±5.04 164.65±4.12 167.33±6.26 168.37±4.45 165.98±5.47 167.39±4.24 168.53±5.19 170.84±4.36對照組 116.35±4.26 117.62±5.93 117.99±5.14 119.41±5.82 121.75±6.42 120.63±7.26 119.79±5.21 120.25±6.14 t 26.330 22.562 21.102 23.150 18.166 19.266 22.959 23.272 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

表3 兩組頸動脈血管結構參數比較（）

表3 兩組頸動脈血管結構參數比較（）

組別 n 腔徑（μm） 中膜厚度（μm） 中膜橫截面積（mm2） 中膜厚度/腔徑（%）觀察組 12 593.84±67.51 87.65±7.62 0.226±0.044 13.16±2.53對照組 12 800.67±78.26 49.38±6.74 0.187±0.032 6.78±1.49 t 6.932 13.032 2.483 7.527 P＜0.001 ＜0.001 0.021 ＜0.001

表4 miR-126與頸動脈重構的相關性分析

圖1 Ⅰ型膠原蛋白和Ⅲ型膠原蛋白在對照組和觀察組的相對表達

2.4 miR-126在頸動脈組織的表達

RT-PCR結果顯示觀察組miR-126表達顯著低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2。

圖2 miR-126在對照組和觀察組頸動脈的相對表達量

2.5 miR-126表達與頸動脈血管重構相關性分析

經Pearson相關性分析，發現miR-126與中膜厚度、中膜橫截面積、中膜厚度/腔徑、ColⅠ型膠原蛋白和ColⅢ型膠原蛋白表達均為負相關（P＜0.05），miR-126與腔徑均無顯著相關性，見表4。

3 討論

高血壓是常見心血管疾病，也是導致心血管不良事件的主要原因之一。目前對原發性高血壓的具體發病機制尚不清楚，隨著研究的深入，近年來，基礎醫學發現血管重構既是高血壓患者重要的病理改變表現，同時又是維持高血壓狀態、導致靶器官受損的原因[11]。頸動脈是脊椎動物最主要的大動脈之一，該動脈的管壁含有大量的膠原蛋白和彈性蛋白，具有良好的彈性，以緩沖血壓的沖擊[12-13]。高血壓患者的血管變化主要為血管壁變硬，彈性下降，順應性下降，血管管腔變窄，對血壓的緩沖能力減弱。miRNA是一段保守的單鏈非編碼RNA，可以調控人體約30%的基因表達，參與細胞的增殖和凋亡，被稱為是基因的轉錄后調節器[14]。近年來研究發現miRNA參與高血壓的發病過程，但其與血管重構是否存在相關性還有待研究[15-16]。

本研究以SHR大鼠為觀察組，WKY大鼠為對照組，研究兩組的血壓和頸動脈血管結構差異。發現從20～34周，觀察組大鼠收縮壓均符合高血壓特征，且顯著高于對照組。34周齡時，觀察組大鼠頸動脈血管腔徑明顯縮小，中膜厚度、中膜橫截面積、中膜厚度/腔徑明顯增加。而血管壁變厚、中層細胞肥大、細胞外基質擴充是血管重構的最顯著征象[17-18]，在本研究中，觀察組頸動脈血管的形態發生顯著變化，為頸動脈發生重構提供一定的證據。細胞外基質的改變是血管重構的另一重要特征，在血管壁增厚變硬的過程中，膠原纖維的含量直接決定血管的彈性。Col Ⅰ和Col Ⅲ型膠原蛋白是細胞外基質的主要成分，兩者的表達變化是血管壁重構的基礎。本研究發現觀察組Col Ⅰ型和Col Ⅲ型表達顯著增加，且Col Ⅲ型增加較為顯著，說明SHR大鼠頸動脈發生重構，與薛揚等[2]研究報道一致。

miRNA可以通過調控細胞分化、炎癥反應、細胞增殖和內皮功能等多種途徑參與血管重構。研究發現miRNA具有調節內皮細胞生長因子的作用，而內皮細胞是維持血管功能動態平衡的關鍵因素[19]。miR-126是一種特異高表達于內皮細胞的miRNA，其表達水平與內皮細胞功能和血管重構密不可分[20]。本研究發現觀察組miR-126表達顯著低于對照組，說明miRNA低表達可能與血管重構相關。目前相關研究已經證實miR-126可以通過調節相關酶的活性促進血管內皮生長因子和堿性成纖維細胞生長因子的表達來維持內皮功能[21]，體外實驗發現miR-126的敲除會直接影響血管內皮生長因子依賴的下游通路受損，引起血管生產缺陷[22]。miR-126還能通過絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶1通路調節血管結構完整性[23]。進一步分析，發現miR-126的表達水平與中膜厚度、中膜橫截面積、中膜厚度/腔徑、Col Ⅰ和Col Ⅲ均為負相關，說明miR-126低表達可能是導致血管重構的原因之一。

綜上所述，自發性高血壓大鼠頸動脈組織miR-126表達顯著降低，與中膜厚度、中膜厚度/腔徑、Col Ⅰ和 Col Ⅲ均為負相關，miR-126 有望成為高血壓治療的新靶點。