夏枯草膏中異迷迭香酸苷水提工藝優化

王 建 李正國 劉琳琳

山東省濟寧市食品藥品檢驗檢測中心，山東濟寧 272000

夏枯草為唇形科植物夏枯草（Prunella vulgarisL.）的干燥成熟果穗，夏季果穗呈棕紅色時采收，除去雜質，曬干。具有清肝瀉火、明目、散結消腫之功效[1]。臨床用于治療目赤腫痛、目珠夜痛、頭痛眩暈、瘰疬、癭瘤、乳癰腫痛、甲狀腺腫大、淋巴結結核、乳腺增生、高血壓等癥[2-4]。夏枯草主要含有三萜及其苷類、黃酮類、甾醇及其苷類、香豆素、有機酸、揮發油及糖類等成分[5-8]。

夏枯草膏為夏枯草經水加熱回流提取制得的單方制劑，由于不同生產企業制備工藝參數差異較大，目前文獻中對夏枯草膏提取工藝缺乏研究，多以不同濃度乙醇為提取溶劑，以夏枯草中黃酮類成分為指標進行提取工藝的優化[9-12]。現行標準中缺乏產品質量控制專屬性指標，不能對產品原料和成品質量進行有效控制。本研究以夏枯草專屬性成分異迷迭香酸苷為指標，采用正交試驗法優化夏枯草膏的提取工藝，并為完善夏枯草膏質量標準，建立合理的限度提供技術支持。

1 資料與方法

1.1 儀器與材料

高效液相色譜儀型號島津LC-20ADXR，紫外檢測器型號SPD-20A；電子分析天平型號XS205DU；電子天平型號JY3002；電子分析天平型號BS110S。異迷迭香酸苷對照品（純度為97.0%，批號：E-3422）；夏枯草由山東廣育堂國藥有限公司提供（產地為河南），經山東中醫藥大學石俊英教授鑒定為Prunella vulgaris L.。乙腈、冰乙酸均為色譜純，水為實驗用水。

1.2 分析方法的選擇與考察

1.2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo Gold AQ C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；以A：乙腈，B：0.5%冰乙酸溶液為流動相，按程序見表1梯度洗脫；檢測波長為320nm；流速1.0mL/min；柱溫為35℃。理論板數按異迷迭香酸苷峰計算應不低于4000。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取異迷迭香酸苷13.94mg，置100mL棕色量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取10mL，置50mL棕色量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。精密吸取對照品溶液10μL，進樣，記錄色譜圖（圖1）。

1.2.3 供試品溶液的制備 精密量取夏枯草提取液15mL，置100mL燒瓶中，回收溶劑至干，精密加入70%甲醇50mL，密塞，稱定重量，超聲處理（功率250W，頻率40kHz)30min，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，作為供試品溶液。精密吸取供試品溶液10μL，進樣，記錄色譜圖（圖2）。

圖1 對照品溶液的HPLC圖

圖2 供試品溶液的HPLC圖

1.2.4 方法學考察

1.2.4.1 線性關系考察 精密吸取對照品儲備液（0.1352mg/mL）各 1、2、3、5、10、15mL,分別置 50mL量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在上述色譜條件下測定，記錄峰面積。以進樣量（μg）為橫坐標X，以對照品的峰面積為縱坐標Y，繪制標準曲線，進行回歸處理，得異迷迭香酸苷線性回歸方程為：Y=1097 048X-1862（r=1.00，n=6）。結果表明，異迷迭香酸苷在0.0270～0.4057μg范圍內，與峰面積線性關系良好。見表2。

表2 線性關系考察

1.2.4.2 精密度試驗 精密吸取上述對照品溶液10μL，按上述色譜條件連續進樣5次。結果異迷迭香酸苷峰面積的RSD為0.8%，表明儀器的精密度良好。

1.2.4.3 穩定性試驗 取同一批供試品溶液，室溫放置，分別于 0、2、4、6、8、10、12h 后吸取 10μL 進樣測定，結果異迷迭香酸苷峰面積的RSD分別為1.0%，表明供試品溶液在12h內穩定性良好。

1.2.4.4 重復性試驗 按“1.2.3”項下供試品溶液的制備方法平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件進行測定，結果異迷迭香酸苷平均含量（mg/g）為0.490,RSD為1.2%，表明該方法重復性良好。

1.2.4.5 加樣回收試驗 精密加入異迷迭香酸苷對照品溶液2mL（濃度為0.271mg/mL）6份，置平底燒瓶中，回收溶劑至干。精密量取已知含量的同一樣品溶液10mL,分別置上述平底燒瓶中，依法制備供試品溶液，測定異迷迭香酸苷含量，計算加樣回收率，結果平均回收率為99.2%，RSD為1.2%（n=6）。見表 3。

1.3 夏枯草提取工藝的優化

1.3.1 影響因素水平的選擇 在查閱文獻資料和實測夏枯草吸水量（為藥材的7倍）基礎上，選擇提取溶劑用量、提取次數、提取時間及浸泡時間為考察的四個因素，考察各因素對提取率影響的主次順序。見表4。

1.3.2 指標的確認 以夏枯草專屬性成分異迷迭香酸苷含量為評價指標。

2 結果

2.1 正交試驗結果

依據正交試驗L9（34）設計，稱取9份藥材，每份約10g，參照表5中的因素與水平進行試驗，合并每個試驗號對應的提取液，過濾，減壓濃縮并定容至100mL。測定異迷迭香酸苷的含量，見表5。

表3 加樣回收試驗（n=6）

表4 正交試驗因素水平表

表5 L9(34)正交表實驗結果

表6 方差分析表

2.1.1 結果分析 直觀分析和方差分析，方差分析見表6。

對表5中的結果進行直觀分析可知，影響提取效果的因素順序B＞D＞A＞C，即提取次數＞浸泡時間＞用水量＞提取時間。最佳工藝為A3B3C2D1，即加12倍量水，藥材浸泡1h，提取3次，每次1.5h。

經方差分析，由表6可知A、B、C、D因素對提取效果的影響無統計學意義，考慮到夏枯草藥材的吸水量和異迷迭香酸苷的得率，提取條件優化為浸泡1h，提取3次（溶劑用量分別為藥材的18倍、10倍、8倍），每次1.5h。

2.1.2 驗證試驗 稱取藥材3份，每份約10g，按優化后工藝參數進行提取，測定異迷迭香酸苷的含量。結果含量分別為 0.502、0.506、0.504mg/g，RSD為0.4%。

3 討論

3.1 提取工藝選擇

通過查閱文獻,發現夏枯草所含成分以水溶性成分為主,如總黃酮、總酚、總皂苷等，故選擇以水作為提取溶劑。綜合考慮各成分溶解性能和生產成本,本實驗選擇用水煎煮的方法進行提取。

3.2 色譜條件的優化

本實驗對異迷迭香酸苷含量測定方法進行了優化，由于異迷迭香酸苷含量較低，相鄰色譜峰難以分離，參考文獻[13-16]中采用 Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），流動相為乙腈-1.0%醋酸水溶液，采用梯度洗脫方式，在該色譜條件下，樣品中異迷迭香酸苷峰與相鄰色譜峰不能達到基線分離。本研究在參考有關文獻基礎上,采用乙腈-0.5%冰乙酸溶液進行梯度洗脫，異迷迭香酸苷峰與相鄰色譜峰達到基線分離，分離度大于1.5，異迷迭香酸苷保留時間為33min。

3.3 正交試驗參數和評價指標的選擇

通過正交試驗法對夏枯草中異迷迭香酸苷的提取工藝進行了優化，得到較為理想的提取條件優化，即浸泡1h，提取3次（溶劑用量分別為藥材的18倍、10倍、8倍），每次1.5h，并按照最佳工藝進行了試驗，測定的結果平均值高于正交設計表中的最高值，結果表明用該工藝提取夏枯草中異迷迭香酸苷效果較好。同時對夏枯草藥材中異迷迭香酸苷的含量進行了測定，為建立夏枯草膏中異迷迭香酸苷的含量限度提供了參考。