基于16S rDNA快速鑒定細(xì)菌的PCR測序方法的建立及其進(jìn)化關(guān)系分析

宋路萍 楊振蘋 王 斌 邢體坤 郝一楠 江 魁 王亞萍 黃 帥 張靜靜▲

1.華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心，河南新鄉(xiāng) 453003；2.華蘭基因工程有限公司質(zhì)量控制部，河南新鄉(xiāng) 453000

微生物污染是制藥企業(yè)生產(chǎn)過程控制及藥品質(zhì)量評(píng)估的重要指標(biāo)，也是影響消費(fèi)者用藥安全的關(guān)鍵因素[1]。美國FDA公布的藥品召回事件中，由微生物污染風(fēng)險(xiǎn)引起的召回事件占到了49%以上[2]。藥品微生物控制是藥品安全性保障的重要措施。因此加強(qiáng)藥品生產(chǎn)過程微生物監(jiān)管和風(fēng)險(xiǎn)控制是保障藥品質(zhì)量、降低用藥風(fēng)險(xiǎn)的重要途徑[3]。在藥品生產(chǎn)的微生物質(zhì)量控制中，實(shí)現(xiàn)微生物“屬”及“種”水平的準(zhǔn)確鑒定，對(duì)控制藥品質(zhì)量以及保障消費(fèi)者用藥安全具有重要意義[4-5]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，微生物鑒定技術(shù)也得到飛速發(fā)展。近年來，各種基因診斷技術(shù)在細(xì)菌檢測中不斷開發(fā)、利用，尤其是基于聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）的基因診斷技術(shù)發(fā)揮著越來越重要的作用，是細(xì)菌鑒定技術(shù)發(fā)展的主要趨勢。研究表明，在細(xì)菌細(xì)胞中RNA堿基的變化比整個(gè)基因組的變化要慢得多，保守得多，這是因?yàn)镽NA的功能一直沒有發(fā)生變化。因此有細(xì)菌“活化石”之稱[6]。現(xiàn)代微生物學(xué)中,利用16S rDNA序列來鑒定細(xì)菌的種類以及分析它們之間的進(jìn)化關(guān)系正在被成功運(yùn)用?；蛐丸b定技術(shù)如16S rRNA序列比對(duì)方法可以鑒定多數(shù)細(xì)菌，已得到廣泛應(yīng)用[7-8]。但有研究表明，16S rRNA序列比對(duì)方法和RiboPrinter微生物鑒定系統(tǒng)，對(duì)一些近緣菌種有一定的鑒定局限性[9-10]。

1 材料與方法

1.1 供試品

細(xì)胞培養(yǎng)物中分離的未知菌種（編號(hào)為JY-01）與已知菌種（編號(hào)為JY-02），由華蘭生物工程股份有限公司研發(fā)中心提供。

1.2 材料信息

Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒、SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物，Taq Plus DNA聚合酶、瓊脂糖H、4S Red Plus核酸染色劑（10 000 ×水 溶 液）購 自 BBI，GeneRuLer DNA Ladder Mix 購自 Thermo Scientific。Taq Plus DNA 聚 合 酶、10×PCR Buffer（含 Mg2+）、dNTP（10mM）、滅菌去離子水購自生工生物，引物27F:AGAGTTTGATCMTGGCTCAG；1492R:GGTTACCTTGTTACGACTT；由生工生物合成。

1.3 儀器設(shè)備

潔凈工作臺(tái)購自江蘇蘇潔凈化設(shè)備廠，PCR反應(yīng)擴(kuò)增儀購自BIO-RAD，高速微量離心機(jī)購自Eppendorf，電泳儀、電泳槽購自北京六一生物科技有限公司，凝膠成像系統(tǒng)購自ProteinSimple，微量分光光度計(jì)購自美國Thermo公司。渦旋混勻器購自美國精騏有限公司，恒溫培養(yǎng)箱購自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司，恒溫振蕩器購自美國Thermo公司，離心機(jī)購自德國賽多利斯公司。

1.4 樣品處理

革蘭染色法是細(xì)菌學(xué)中廣泛使用的一種鑒別染色法，通過染色初步確定未知菌種為革蘭陰性細(xì)菌或者革蘭陽性細(xì)菌。陽性細(xì)菌需加入100μL Buffer Digestion和 80μL溶菌酶溶液（重懸菌液，37℃水浴 30min）。

1.5 基因組DNA的提取

利用試劑盒的方法進(jìn)行基因組DNA的提取，采用裂解和相分離技術(shù)，結(jié)合DNA制備膜選擇性地吸附DNA的方法達(dá)到純化基因組DNA的目的。

1.6 DNA質(zhì)量的電泳檢測

1.6.1 制膠 根據(jù)目的片段的大小確定膠體濃度。以1%濃度為例：稱取0.5g瓊脂糖放入燒杯中，并加入50mL 1×TAE緩沖液，用微波爐加熱溶解至溶液澄清透明。在凝膠托盤中插入梳子，倒入凝膠，待凝膠成形后使用。

1.6.2 上樣 瓊脂糖凝膠在使用前拔掉梳子，放入電泳槽中，點(diǎn)樣孔在負(fù)電極方，加入適量的1×TAE緩沖液使其液面高出凝膠2～3mm，用移液槍取3μL DNA樣品，加入0.2μL核酸染色液以及0.8μL 10×上樣緩沖液，混勻后加4μL到凝膠點(diǎn)樣孔中。

1.6.3 電泳 連接好導(dǎo)線（相同顏色的導(dǎo)線與插口相連），開啟電泳儀，調(diào)節(jié)8V/cm（電壓180V；電流300mA）電泳15～20min，停止電泳。

1.6.4 成像 使用ProteinSimple凝膠成像系統(tǒng)在UV模式下對(duì)電泳結(jié)束的瓊脂糖凝膠進(jìn)行成像拍照。

1.7 引物設(shè)計(jì)

16s rDNA的保守區(qū)為所有細(xì)菌共有，細(xì)菌之間無顯著差異[11-12]。設(shè)計(jì)引物軟件用Primer Premier 5，在保守區(qū)設(shè)計(jì)通用引物。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物長度：位點(diǎn)測序引物在150～300bp左右，離位點(diǎn)80～150bp，外顯子檢測引物離外顯子上下游150bp左右；目的基因測序的PCR產(chǎn)物條帶一般不超過1200bp。

1.8 PCR反應(yīng)體系及條件

PCR 反應(yīng)體系為：Taq Buffer（10×with MgCl2）5μL，dNTP（mix）2μL，引 物 F（10μM）2μL，引物 R（10μM）2μL，Taq酶（5U/μL）0.5μL，模板DNA（20～50ng/μL）2μL。PCR反應(yīng)條件為：95℃10min激活Taq聚合酶；95℃變性15s，60℃退火和延伸1min，共40個(gè)循環(huán)。

1.9 電泳檢測

PCR產(chǎn)物取5μL 1%瓊脂糖凝膠電泳，電泳參數(shù)：150V，100mA，10～ 20min電泳成像。PCR產(chǎn)物電泳條帶為所需DNA目的條帶，PCR獲得的DNA產(chǎn)物送交生工生物進(jìn)行核酸序列測定。

1.10 數(shù)據(jù)分析

屬于國家生物信息中心的核酸數(shù)據(jù)庫有GenBank（www.ncbi.nlm.nih.gov）、核糖體Ⅱ期工程數(shù)據(jù)庫（http://rdp.cme.msu.edu/html）、效基因 IDNS數(shù)據(jù)庫（www.smartgene.ch）等，通常選兩個(gè)或以上數(shù)據(jù)庫進(jìn)行橫向比對(duì)[11]。將測序公司回饋的序列進(jìn)行分析，測序圖譜（.abl）使用說明：峰圖文件（.abl）可用Chromas軟件或SeqMan軟件打開。在SeqMan軟件中打開，去除峰型圖不準(zhǔn)的堿基，將上游引物和下游引物的測序結(jié)果拼接在一起，保存拼接好的序列。16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）上比對(duì)；利用BLAST軟件從GenBank數(shù)據(jù)庫中搜索相關(guān)菌株的16S rDNA全序列，采用Clustal X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)和同源性分析，確定細(xì)菌的種屬，并做系統(tǒng)發(fā)生樹加以分析。

2 結(jié)果

2.1 革蘭染色結(jié)果

將平板培養(yǎng)分離得到的微生物進(jìn)行革蘭染色，顯微鏡觀察初步判斷為革蘭陽性桿菌，見圖1。

圖1 分離未知菌種革蘭染色結(jié)果

2.2 DNA電泳檢測

取5μL DNA溶液1%瓊脂糖、1×TAE緩沖溶液電泳（電壓120～180V）檢測，見圖2。單一條帶說明DNA完整無降解，有明顯的條帶說明濃度可以滿足PCR要求；并用分光光度計(jì)檢測濃度和純度，取 1μL檢 OD 值，OD 260/280 在 1.7～ 2.0，說明DNA質(zhì)量較好，小于1.7有蛋白污染，大于2.0有RNA污染。一般有少量的蛋白與RNA污染不影響普通PCR。

2.3 PCR電泳檢測

取 5μL DNA 溶液 1%瓊脂糖、1×TAE緩沖溶液電泳（電壓120～180V）檢測，PCR產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳顯示出的條帶圖譜見圖3。目的條帶為1500bp左右，與理論值相符。單一條帶說明無特異性擴(kuò)增條帶。

圖2 JY-01和JY-02 DNA電泳檢測圖

圖3 JY-01和JY-02 PCR電泳檢測圖

2.4 測序結(jié)果分析

該技術(shù)主要依賴生物遺傳結(jié)構(gòu)的多樣性，對(duì)特定的靶基因通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增后，將擴(kuò)增產(chǎn)物片段進(jìn)行測序。樣本16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫（http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp）及GenBank數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）中進(jìn)行比對(duì)，最終得出菌種鑒定結(jié)果。圖4為JY-01樣本16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果。

未知菌種的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過測序，結(jié)果拼接為1500bp的片段。將JY-01與參考序列按照不同的結(jié)構(gòu)基因和功能基因以及全基因組分別進(jìn)行了核苷酸同源性分析，結(jié)果見圖5（JY-01樣本分離的未知菌株系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果）。

圖4 JY-01樣本16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果

圖5 JY-01樣本分離的未知菌株系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果

圖6 JY-02樣本16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果

圖7 JY-02樣本分離的已知菌株系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果

圖8 JY-02樣本與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列同源性比對(duì)結(jié)果

根據(jù)JY-01樣本16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫及GenBank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)結(jié)果，JY-01樣本被鑒定為Bacillus（桿菌屬），疑似為Bacillus halodurans（耐鹽芽孢桿菌）或Bacillus clausii（克勞氏芽孢桿菌）。其分類單元為：Bacteria；Firmicutes；Bacilli；Bacillales；Bacillaceae；Bacillus。

圖6為JY-02樣本16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫比對(duì)結(jié)果。圖7為JY-02樣本分離的已知菌株系統(tǒng)發(fā)生樹分析結(jié)果。根據(jù)JY-02樣本16S rDNA序列在核糖體數(shù)據(jù)庫及GenBank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)結(jié)果，見圖8。JY-02樣本被鑒定為Escherichia coli（大腸埃希桿菌）。其分類單元為：Bacteria；Proteobacteria；Gammaproteobacteria；Enterobacterales；Enterobacteriaceae；Escherichia。鑒定結(jié)果與已知菌種信息一致，說明該方法可以用于微生物鑒定。

圖8為JY-02樣本16S rDNA序列在GenBank數(shù)據(jù)庫中比對(duì)結(jié)果。結(jié)果顯示JY-02樣本與GenBank數(shù)據(jù)庫中CP040067.1序列同源性高達(dá)99.7%。JY-02樣本被鑒定為Escherichia coli（大腸埃希桿菌）。由于JY-01僅僅鑒定到屬，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求，如需進(jìn)行鑒定至種，需要進(jìn)行二代測序。

3 討論

鑒定病原細(xì)菌有多種方法，如形態(tài)學(xué)觀察、血清分型、生化分析、遺傳學(xué)分析等。遺傳學(xué)分析法有基因序列分析、分子標(biāo)記檢測、核酸分子雜交等[13]。16S rRNA基因在基因序列分析中應(yīng)用最多[14]。16S rDNA鑒定是指用利用細(xì)菌16S rDNA序列測序的方法對(duì)細(xì)菌進(jìn)行種屬鑒定。包括細(xì)菌基因組DNA提取、16S rDNA特異引物PCR擴(kuò)增、擴(kuò)增產(chǎn)物純化、DNA測序、序列比對(duì)等步驟。是一種快速獲得細(xì)菌種屬信息的方法。16S rRNA普遍存在于原核生物中。rRNA參與生物蛋白質(zhì)的合成過程，其功能是任何生物都必不可少的，而且在生物進(jìn)化的漫長歷程中保持不變，可看作為生物演變的時(shí)間鐘。在16S rRNA分子中，既含有高度保守的序列區(qū)域，又有中度保守和高度變化的序列區(qū)域，因而它適用于進(jìn)化距離不同的各類生物親緣關(guān)系的研究。目前，傳統(tǒng)鑒定技術(shù)存在敏感度低、耗時(shí)長的缺點(diǎn)，如通過表現(xiàn)型鑒定的生化分析過程存在較多不確定因素[14]。比較而言，基因型更穩(wěn)定受環(huán)境因素影響較小[15-16]。因此，本研究建立的16S rRNA基因序列分析法較生化分析法更加穩(wěn)定。同時(shí)建立一種快速可靠、成本低廉、操作簡便的快速鑒定細(xì)菌的PCR測序方法的建立是非常有必要的。