雙氫青蒿素通過調控PI3K/AKT通路增強肝癌H22細胞荷瘤小鼠放療效果*

徐靖達， 楊公利， 杜井峰， 徐 龍， 周燕紅△

（1湖北科技學院五官醫學院，湖北咸寧437100；2深圳大學總醫院消化內科，深圳大學臨床科學研究院腫瘤中心，廣東深圳518055）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上常見的惡性腫瘤之一，其發病率居全身惡性腫瘤的第6 位，死亡率位居第3 位，隨著人們飲食習慣的改變和環境污染程度加深，全世界HCC 發病率快速攀升，每年因肝癌死亡的患者高達80 萬人［1-2］。我國作為HCC 高發地區，每年因HCC 死亡患者約占全世界總數的35%，近幾年仍呈不斷上升的趨勢，嚴重危害人們的生命健康安全，以往臨床上治療HCC 主要采取手術切除為主，放療和化療為輔的手段［3-4］。隨著放療在臨床上的應用，精確放療逐漸成為治療HCC 的重要手段，但放療會使機體產生耐受性，導致療效降低［5-6］。因此，尋找毒副作用小、增敏效果強的增敏藥物對提高放療效果意義重大。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，AKT）信號通路在腫瘤的發生發展及腫瘤細胞的增殖和凋亡進程中發揮作用，研究顯示，通過阻斷PI3K/AKT 通路的活化，可以增加食管癌細胞的放療敏感性［7］，提示PI3K/AKT 通路與腫瘤放療增敏有關。雙氫青蒿素（dihydroartemisinin，DHA）是青蒿素體內代謝的主要產物，可通過干擾線粒體-表膜功能，發揮抗炎、免疫調節和抗腫瘤作用［8］。研究顯示，DHA 可通過PI3K/AKT 信號通路誘導腫瘤細胞凋亡，起抗腫瘤的作用［9］。然而，DHA 能否通過調控 PI3K/AKT 信號通路以增強肝癌H22 細胞荷瘤小鼠放療效果尚未可知，因此本研究構建肝癌H22 細胞荷瘤小鼠模型，觀察不同劑量DHA 聯合放療對荷瘤小鼠放療增效和腫瘤生長抑制的影響，并探討相關因子和PI3K/AKT信號通路蛋白的變化。

材料和方法

1 材料

1.1 試劑和儀器 DHA（貨號：81496-82-4）購自上海瀚鴻科技股份有限公司；特級胎牛血清（貨號：S9000）、RMPI-1640 培養液（貨號：31800）、白細胞介素 2（interleukin-2，IL-2）ELISA 試劑盒（貨號：SEKM-0008）和 IL-4 ELISA 試劑盒（貨號：SEKM-0005）均購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人AKT抗體（貨號：K10080-ZRF）和兔抗人p-AKT 抗體（貨號：K10770-IZK）均購自北京百奧萊博科技有限公司；羊抗兔II 抗（貨號：FNSA-0015）購自武漢菲恩生物科技有限公司；PrimeScript RT 試劑盒（貨號：RR037A）購自 TaKaRa。iBright FL1500 智能成像系統購自Thermo Fisher Scientific。

1.2 細胞株和動物 H22 腹水型HCC 細胞株購自中科院上海細胞庫，常規培養，培養液為含10%胎牛血清、1×105U/L 青霉素和 100 mg/L 鏈霉素的 RMPI-1640 培養液，培養條件為飽和濕度、5% CO2、37℃恒溫培養箱，隔天換液，胰酶消化傳代，取對數生長期的H22 細胞用于實驗。SPF 級昆明小鼠購自四川大學實驗動物中心，許可證號為SCXK（川）2018-0002，體重18～22 g，6～8 周齡，雌雄各半，均常規適應性培養一周后用于后續實驗。

2 方法

2.1 建造肝癌H22 細胞荷瘤小鼠模型 用預冷的生理鹽水調整H22 細胞密度為1.0×1010/L，用75%乙醇消毒待注射部位皮膚，用無菌注射器將細胞懸液以每只0.2 mL 的體積接種于小鼠右肢皮下。待小鼠瘤直徑約7 mm 時，剝離皮下腫瘤，繼續按照上述步驟在小鼠體內傳代，以第3 代荷瘤小鼠作為模型進行后續實驗。

2.2 實驗動物分組及給藥方法 荷瘤小鼠模型構建成功1 周后，根據小鼠腫瘤大小均勻分組，每組8只，分別為：（1）模型（model）組；（2）單放療（single radiotherapy）組；（3）5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU；25 mg/kg［10］）組；（4）DHA 低劑量（25 mg/kg）組；（5）DHA 中劑量（50 mg/kg）組；（6）DHA 高劑量（100 mg/kg）組［11］。DHA在超聲條件下用DMSO配制成母液，隨后用RMPI-1640 培養液稀釋至所需濃度（DMSO終體積＜0.1%）。陽性藥5-FU和DHA均在放療前30 min 腹腔注射，給藥體積為每只200 μL。模型組腹腔注射含有等體積分數DMSO 的生理鹽水。每天1 次，治療21 d。放療方法：在各組小鼠清醒狀態下，以137Cs 作為照射源，照射劑量5 Gy，照射劑量率0.50 Gy/min。暴露小鼠腫瘤部位，其余部位均用鉛板遮擋。

2.3 觀察指標 隔天測量各組荷瘤小鼠體重和瘤體積。觀察小鼠一般活動狀態和精神面貌。給藥結束后，取血并立刻脫頸處死各組荷瘤小鼠，剝離腫瘤，稱重并記錄，測定淋巴細胞轉化程度［脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和伴刀豆球蛋白A（concanavalin A，ConA）刺激指數（stimulating index，SI）］和自然殺傷（natural killer，NK）細胞活性（采用MTT法測定）。根據公式計算增敏系數（enhancement factor，EF）、腫瘤生長抑制率和腫瘤生長延緩時間。腫瘤生長抑制率（%）=（1-治療組平均瘤重/模型組平均瘤重）×100%；腫瘤生長延緩時間（tumor growth delay，TGD）=治療組TGT3-空白組TGT3（TGT3指腫瘤體積生長至放射治療前3 倍所需時間）；EF=給藥組TGD/單放療組TGD。當EF＞1，說明藥物具有放療增效作用。

2.4 ELISA 法檢測各組小鼠血清因子 治療結束后，鼠尾抽取各組小鼠外周血，靜置30 min，離心取上清，按照ELISA試劑盒說明書測定IL-2和IL-4水平。

2.5 RT-qPCR 測定各組小鼠腫瘤組織中PI3K 和AKT mRNA 表達水平 從液氮中取出各組荷瘤小鼠腫瘤組織，提取組織總RNA，用PrimeScript RT 試劑盒合成cDNA，以其為模板，進行PCR 擴增。反應條件：預變性95℃ 3 min；變性95℃ 5 s，退火60℃ 30 s，48 個循環。PI3K 的上游引物序列為5'-CTCCACGACCATCATCAG-3'，下游引物序列為 5'-TTCTTCACGGTTGCCTAC-3'；AKT 的上游引物序列為 5'-GTATGCTGGCAGAGTAGGAGAAC-3'，下游引物序列為5'-CAGGTAACATCAGAGACAGACACA-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-GATACAGTTCCCGTGTTGTTGAC-3'，下游引物序列為5'-CATAAAGACACATAACACCACACTC-3'。以 GAPDH 為內參照，采用2-ΔΔCt法計算PI3K和AKT的相對表達量。

2.6 Western blot 法測定各組小鼠腫瘤組織中PI3K、AKT 和p-AKT 的蛋白表達水平 從液氮中取出各組荷瘤小鼠腫瘤組織，置于含有蛋白酶抑制劑的研缽中，研磨均勻，根據BCA試劑盒說明書測定總蛋白含量，與20 μL 5×緩沖液混合，100℃預處理10 min，凝膠電泳分離目標蛋白，低壓80 V、30 min，高壓120 V、90 min，濕法轉膜，5%脫脂奶粉封閉后加入I 抗（1∶1 000 稀釋），4℃下孵育過夜，再加入II 抗（1∶1 000稀釋），室溫雜交1 h，顯色，測定條帶灰度值。蛋白相對含量=目標蛋白灰度值/內參照蛋白灰度值。

3 統計學處理

使用SPSS 22.0 軟件對數據進行統計分析。數據以均數±標準差（mean±SD）表示。多組間均數比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 不同劑量的DHA 對H22 細胞荷瘤小鼠的放療增效作用

與模型組相比，單放療組TGT3顯著升高（P＜0.05），與單放療組相比，低、中、高劑量DHA 組TGT3進一步升高（P＜0.05），隨著DHA 劑量的升高而升高（P＜0.05），高劑量組TGT3與5-FU組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；各劑量DHA 組EF 隨著DHA 劑量的升高而升高（P＜0.05），高劑量組與5-FU 組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 DHA聯合放療對荷瘤小鼠腫瘤生長的影響Table 1.Effect of DHA combined with radiotherapy on tumor growth in tumor-bearing mice（Mean±SD. n=8）

2 不同劑量的DHA 聯合放療對H22 細胞荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用

與模型組相比，單放療組腫瘤體積和重量均顯著降低（P＜0.05），與單放療組相比，低、中、高劑量DHA 組腫瘤體積和重量進一步降低（P＜0.05），且隨著DHA 劑量的升高而降低（P＜0.05），高劑量組與5-FU 組相比差異無統計學意義（P＞0.05）；與單放療組相比，各劑量DHA 組抑瘤率均顯著升高（P＜0.05），且隨著DHA 劑量的升高而升高（P＜0.05），高劑量組與5-FU 組相比差異無統計學意義（P＞0.05），見圖1、2和表2。

Figure 1.Representative images showing the size of the tumors from tumor-bearing mice in each group.A：model group； B： single radiotherapy group； C： 5-FU group；D：low-dose DHA group；E：middle-dose DHA group；F：high-dose DHA group.圖1 各組荷瘤小鼠腫瘤大小的代表性圖片

3 各組荷瘤小鼠淋巴細胞轉化程度和NK細胞活性

與模型組相比，單放療組荷瘤小鼠淋巴細胞轉化程度和NK細胞活性均顯著降低（P＜0.05）；與單放療組相比，低、中、高劑量DHA 組淋巴細胞轉化程度和NK 細胞活性均顯著升高（P＜0.05），且隨著DHA劑量的升高而升高（P＜0.05）；5-FU 組淋巴細胞轉化程度和NK細胞活性均低于DHA組，見表3。

4 各組小鼠血清IL-2和IL-4水平

與模型組相比，單放療組荷瘤小鼠血清IL-2 和IL-4 水平顯著降低（P＜0.05）；與單放療組相比，各劑量DHA 組荷瘤小鼠血清IL-2 和IL-4 水平顯著升高（P＜0.05），且隨著 DHA 劑量的升高而升高（P＜0.05）；5-FU 組小鼠血清 IL-2和IL-4 水平均低于DHA組，見表4。

Figure 2.Changes of tumor volume in tumor-bearing mice of each group.Mean±SD. n=8.*P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs single radiotherapy group；△P＜0.05 vs low-dose DHA group；▲P＜0.05 vs middledose DHA group.圖2 各組荷瘤小鼠腫瘤體積的變化

表2 不同劑量的DHA 聯合放療對H22 細胞荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用Table 2.Inhibitory effect of different doses of DHA combined with radiotherapy on tumor growth in H22 cell tumorbearing mice（Mean±SD. n=8）

表3 各組荷瘤小鼠淋巴細胞轉化程度和NK細胞活性Table 3.lymphocyte transformation degree and NK cell activity of tumor bearing mice in each group（Mean±SD.n=8）

表4 各組小鼠血清因子IL-2和IL-4水平Table 4.The levels of serum factors IL-2 and IL-4 in each group（ng/L.Mean±SD. n=8）

5 DHA 聯合放療對H22 細胞荷瘤小鼠PI3K 和AKT mRNA表達的影響

與模型組相比，單放療組PI3K 和AKT 的mRNA表達水平顯著降低（P＜0.05）；與單放療組相比，低、中、高劑量DHA組PI3K和AKT的mRNA表達水平進一步降低（P＜0.05），且隨著DHA 劑量的升高而降低（P＜0.05），見圖3。

6 DHA 聯合放療對H22 細胞荷瘤小鼠PI3K/AKT通路蛋白表達的影響

與模型組相比，單放療組AKT 表達水平無顯著變化（P＞0.05），PI3K 表達水平和AKT 磷酸化水平顯著降低（P＜0.05）；與單放療組相比，低、中、高劑量DHA 組PI3K 表達水平和AKT 磷酸化水平顯著升高（P＜0.05）；隨著DHA 劑量的升高，PI3K 表達水平和AKT磷酸化水平隨之降低（P＜0.05），見圖4和表5。

討 論

青蒿素是一種抗腫瘤藥物，研究顯示，青蒿素是結直腸癌細胞株的輻射敏感劑，可以顯著增加放射線對結直腸癌Lovo 細胞的抑制作用，強化放射線誘導細胞凋亡的發生［12］。DHA 是青蒿素的衍生物，能夠抑制或殺傷機體大部分腫瘤細胞，有效提高治療肺癌的療效［13］，研究顯示，DHA能明顯抑制肺癌細胞增殖，增加其放療敏感性［14］。本研究顯示，相比于模型組，單放療組和低、中、高劑量 DHA 組 TGT3、EF 和抑瘤率顯著升高，DHA 治療組較單放療組瘤重顯著降低，且呈濃度依賴性，提示DHA 具有放療增效的作用，放療聯合DHA 能夠更好地提高肝癌H22 細胞荷瘤小鼠對放療的敏感性，抑制腫瘤生長。但是，DHA通過哪種途徑以增強放療敏感性還有待進一步研究。

Figure 3.The mRNA expression levels of PI3K and AKT in tumor tissues from H22 cell tumor-bearing mice in different groups.Mean±SD. n=8.*P＜0.01 vs model group；#P＜0.05 vs single radiotherapy group；△P＜0.05 vs low-dose DHA group；▲P＜0.05 vs middledose DHA group.圖3 不同組H22 細胞荷瘤小鼠腫瘤中PI3K 和AKT 的mRNA表達水平

Figure 4.The protein levels of PI3K，AKT and p-AKT in tumor tissues from H22 cell tumor-bearing mice in different groups.A：model group；B：single radiotherapy group；C：5-FU group；D：low-dose DHA group；E：middle-dose DHA group；F：high-dose DHA group.圖4 不同組H22 細胞荷瘤小鼠腫瘤中PI3K、AKT 和p-AKT的蛋白水平

表5 不同組H22細胞荷瘤小鼠腫瘤中PI3K、AKT和p-AKT的蛋白水平Table 5.The protein levels of PI3K，AKT and p-AKT in tumor tissues from H22 cell tumor-bearing mice in different groups（Mean±SD. n=8）

隨著病程的發展和惡化，肝癌患者常伴有免疫功能下降或障礙，特別在接受化療和放療的患者表現更嚴重，影響放療療效，使患者生存質量下降［15］。淋巴細胞增殖程度可反映機體免疫功能，可由淋巴細胞轉化程度體現，IL-2 作為T 細胞亞群生長因子可由 CD4+和 CD8+細胞分泌，可活化 B 細胞增殖［16-17］。IL-4水平是衡量疫苗免疫的重要指標，可誘導Th0細胞分化為 Th2 細胞［18］。此外，NK 細胞高活性可釋放顆粒酶B、IFN-γ、穿孔素等細胞因子，以殺傷腫瘤細胞［19］。本研究顯示，與模型組相比，單放療組荷瘤小鼠淋巴細胞轉化程度、NK 細胞活性及IL-2 和IL-4 水平顯著降低，說明放療降低機體免疫功能；DHA 治療組較單放療組荷瘤小鼠淋巴細胞轉化程度、NK 細胞活性及IL-2 水平和IL-4 水平顯著升高，而5-FU 組均低于DHA 組，說明放療聯合DHA 能夠提高荷瘤小鼠免疫能力，以增強放療效果。

PI3K/AKT 信號通路不僅參與調控腫瘤增殖和凋亡的過程，也與腫瘤細胞放化治療的敏感性密切相關。張明等［20］研究顯示，通過抑制PI3K/Akt 信號通路激活，可以抑制結腸癌細胞增殖，促進細胞凋亡，從而提高結腸癌細胞的放射敏感性。本研究顯示，與模型組相比，單獨放療組中PI3K 和AKT 的mRNA 及PI3K 和p-AKT 的蛋白表達水平顯著降低，說明PI3K/AKT 信號通路與放療治療有關。張雷等［21］研究顯示，DHA 可能通過激活線粒體凋亡途徑并抑制PI3K/AKT 信號通路活性，以增強Rajj 細胞對放射的敏感性。本研究顯示，DHA 治療組較單放療組 PI3K和AKT 的 mRNA 及 PI3K和p-AKT 的蛋白表達水平顯著降低，呈劑量依賴性，高劑量組與5-FU組相當，說明隨著DHA 劑量升高，PI3K/AKT 信號通路活性抑制程度越高，提示DHA 可能通過抑制PI3K/AKT信號通路活性，以增強放療療效。

綜上所述，DHA 可能通過抑制PI3K/AKT 信號通路活性，提高荷瘤小鼠免疫能力，從而增強放療效果。