維甲酸X受體對缺氧/復氧誘導的大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞自噬的調控作用*

高 慧， 周卓琳 ， 樓國強， 張晶晶， 武垣伶， 黃丹娜 ， WU Yi-ming， 王萬鐵△

（1溫州醫科大學缺血/再灌注損傷研究所，浙江溫州325035；2河南大學附屬淮河醫院病理科，河南開封475000；3Division of Cardiovascular Medicine，University of Iowa Carver College of Medicine，Iowa City，IA 5009，USA）

肺缺血/再灌注損傷（lung ischemia reperfusion injury，LIRI）是指肺組織在缺血一段時間后恢復血流供應，組織損傷加重甚至發生不可逆性損傷的現象，是威脅患者預后乃至生命的重要因素［1］。LIRI 的發生發展最終是由肺細胞的損傷來體現的，因此肺泡Ⅱ型上皮細胞（alveolar epithelial cell type Ⅱ，AECⅡ）的缺氧/復氧（hypoxia/reoxygenation，H/R）與機體的LIRI有類比性。細胞自噬是真核生物體內進化高度保守的細胞自穩程序［2］，近年來被證實參與了某些臟器缺血再灌注損傷的病理生理過程［3］。因此，研究細胞自噬可能對肺缺血/再灌注（缺氧/復氧）損傷的防治有一定意義。

維甲酸X 受體（retinoid X receptor，RXR）是細胞核受體超家族中的重要成員之一，包括α、β 和γ 三個亞型，在細胞生物學的特定方面如細胞增殖、凋亡等多種細胞過程中扮演重要角色［4-5］。研究表明，RXRα 在多種疾病過程中發揮重要作用，激動RXR可以抑制缺氧/復氧引起的心肌細胞損傷［6-7］，但對于RXR 在肺細胞缺氧/復氧損傷中的調節作用目前國內外尚未見報道。本實驗通過對大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞進行H/R 處理，模擬人體LIRI 這一病理生理過程，并使用RXR 激動劑和抑制劑進行干預，探討RXR 在H/R 誘導的細胞自噬過程中可能發揮的作用以及調節機制，從而為肺缺血/再灌注損傷的研究和防治提供參考資料。

材料和方法

1 實驗細胞

本實驗細胞為大鼠肺泡Ⅱ型上皮細胞，由上海拜力生物科技有限公司提供。

2 主要試劑及儀器

高糖DMEM 培養液、胎牛血清和胰蛋白酶（Gibco）；9-順式維甲酸（9-cis-retinoid acid，9-RA）和HX531（Sigma）；抗 RXRα、p-AMPK、p-mTOR、beclin 1、LC3-Ⅱ和P62抗體（Abcam）；辣根酶標記山羊抗兔Ⅱ抗（上海博蘊生物科技有限公司）；免疫熒光Ⅱ抗（上海翊圣生物科技有限公司）；引物序列由上海捷瑞生物工程有限公司設計合成；BCA 蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術研究所）；CCK-8 試劑盒（Dojindo）；逆轉錄試劑盒（Thermo）。常氧培養箱和微量冷凍離心機（Themo）；超凈工作臺（蘇州蘇凈安泰醫療器械有限公司）；多功能酶標儀、梯度PCR 儀和蛋白電泳/轉膜系統（Bio-Rad）；熒光化學發光成像系統（上海勤翔科學儀器有限公司）；透射電鏡及成像系統（Hitachi）。

3 主要方法

3.1 AEC Ⅱ的培養 使用DMEM 高糖型培養液（內含10%胎牛血清、1%青、鏈霉素）培養細胞，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中。

3.2 實驗分組 按照隨機數表將細胞分為5 組：對照（control，Con）組、缺氧/復氧（H/R）組、溶劑DMSO組、RXR 激動劑 9-RA 組和 RXR 拮抗劑 HX531 組。Con 組用完全培養液在常氧箱內正常培養30 h；H/R組缺氧（94% N2、1% O2、5% CO2）處理6 h，復氧處理24 h；DMSO 組在缺氧前用終濃度低于0.1% DMSO的培養液處理1.5 h；9-RA 組在缺氧處理前用9-RA（100 nmol/L）預處理1 h；HX531 組在缺氧前先用9-RA（100 nmol/L）預處理 0.5 h，再用 HX531（2.5 μmol/L）預處理1 h，其余處理同H/R組。

3.3 AEC Ⅱ缺氧/復氧損傷模型的制備 在本實驗室前期的研究基礎上，通過預實驗整合改進構建大鼠 AEC Ⅱ的 H/R 模型［8］。將處于對數生長期，形態正常的AEC Ⅱ用不含血清的培養液饑餓處理24 h后，用于H/R 模型復制。缺氧（37℃、94%N2、1%O2、5%CO2）處理時，將含10%FBS的高糖DMEM 培養液換成經高純氮氣飽和處理過的無糖無血清培養液，營造氧糖剝奪的條件處理6 h，復制缺氧模型；再將缺氧液換成無血清的高糖DMEM 培養液，置于常氧箱（37℃、95% O2、5% CO2）恢復氧氣供應培養24 h，復制復氧模型。通過以上處理，模擬細胞缺氧/復氧損傷的病理生理過程。

3.4 CCK-8 檢測細胞活力 按照試劑盒說明書步驟正確操作，每孔按照1×105的細胞密度接種于96孔板，待細胞貼壁后進行各組模型復制。配制CCK-8混合液（CCK-8∶DMEM 培養液=1∶10），每孔110 μL加入樣品孔，將96孔板放入常氧箱孵育0.5～2 h。再用酶標儀測定每孔在450 nm的吸光度（A）值。

3.5 免疫熒光染色法檢測各組細胞RXRα 表達準備細胞爬片、4%多聚甲醛固定細胞、0.1% Triton X-100打孔、5%牛蛋白血清封閉之后，再滴加兔抗鼠RXRα 抗體低溫過夜孵育，次日結合羊抗兔熒光Ⅱ抗，用DAPI 進行核染色，再用含抗熒光淬滅劑的封片液進行封片處理之后，于正置熒光顯微鏡下觀察并拍片。

3.6 透射電鏡觀察細胞超微結構 各組細胞處理完畢，首先用2.5%戊二醛固定液固定30 min，收集細胞并置于4℃冰箱固定過夜。再依次經PBS 緩沖液漂洗，1%鋨酸后固定，1%醋酸鈾塊染，丙酮梯度脫水、浸透，Epon812 環氧樹脂包埋劑包埋聚合，半薄切片，超薄切片，經醋酸鈾-檸檬酸鉛雙重染色，最后使用透射電鏡觀察并拍攝。

3.7 RT-PCR 檢測自噬相關基因mRNA 的表達 用Trizol 法提取總RNA，分光光度計測定RNA 濃度，根據濃度計算上樣體積。依次經逆轉錄合成cDNA、PCR 擴增、2.0%瓊脂糖凝膠電泳、全自動凝膠成像系統曝光成像，最后用Quantity One 軟件分析圖像。PCR 擴增參數為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 1 min，32 個循環；72℃ 5 min。此外，LC3 擴增參數為：94℃ 3 min；94℃ 30 s，65℃ 30 s，72℃ 1 min，28個循環；72℃5 min。引物序列見表1。

表1 RT-PCR的引物序列Table 1.The sequences of the primers for RT-PCR

3.8 Western blot 檢測自噬相關蛋白的表達 造模結束，用預冷的PBS 緩沖液清洗3 次。每皿加1 mL裂解混合液（PMSF∶RIPA=1∶100）于冰上裂解 30 min。細胞刮適當研磨細胞，收集細胞懸液并離心沉淀，收集上清。BCA 試劑盒測定蛋白濃度后，高溫下蛋白變性。進行SDS-PAGE，轉膜（濕轉）、10%脫脂牛奶封閉 2 h，TBST 洗膜，再結合I 抗（p-AMPK、beclin 1、p-mTOR、P62 抗體均以 1∶1 000 稀釋；LC3-Ⅱ以 1∶2 000 稀釋；GAPDH 以 1∶10 000 稀釋），4℃孵育過夜。次日結合Ⅱ抗約1 h，TBST 洗膜3 次，滴加ECL 發光液暗室內孵育2 min，再用熒光化學發光成像系統進行曝光拍攝，用Quantity One 軟件分析圖像灰度值。

4 統計學處理

采用SPSS 17.0 統計軟件分析。所有計量資料以均數±標準差（mean±SD）表示，并進行正態性檢驗。多組樣本均數組間采用單因素方差分析，兩兩比較使用LSD-t檢驗，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組細胞活力的變化

與Con 組相比，其余4 組細胞的A值均顯著下降（P＜0.05）；與DMSO 組相比，9-RA 組的A值顯著上升（P＜0.05）；與 9-RA 組相比，HX531 組的A值顯著降低（P＜0.05）；而H/R、DMSO 和HX531 組之間兩兩相比，A值無顯著差異（P＞0.05），見圖1。

Figure 1.The expression change of A value in all groups.Mean±SD. n=5.▲▲P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs H/R group；**P＜0.01 vs DMSO group；△△P＜0.01 vs 9-RA group.圖1 CCK-8法檢測的各組細胞A值變化

2 免疫熒光法檢測各組細胞RXRα表達的結果

熒光顯微鏡下可見，與Con 組相比，其余4 組細胞中的 RXRα 表達增多；而與 DMSO 組相比，9-RA 組的 RXRα 表達增多；與 9-RA 組相比，HX531 組細胞的 RXRα 表達顯著減少；而 H/R、DMSO和HX531 3組兩兩相比，細胞中RXRα 表達無顯著差異（P＞0.05），見圖2。

3 各組細胞電鏡觀察結果

透射電鏡下可見，Con組肺泡Ⅱ型上皮細胞結構未見異常，線粒體結構呈梭形，結構正常，數目豐富且嵴線清晰，板層小體豐富且結構正常；與Con 組相比，其余4 組細胞內部結構出現不同程度的紊亂，其中H/R、DMSO 和HX513 3 組肺泡Ⅱ型上皮細胞內線粒體發生高度水腫，線粒體嵴線溶解甚至消失，偶見變異性的增生，板層小體出現空泡化且數目減少，可觀察到自噬溶酶體、降解性細胞自噬體出現；9-RA組相較于 H/R、DMSO和HX531 3 組，肺泡Ⅱ型上皮細胞損傷減輕，線粒體僅出現輕微腫脹，結構相對較為完整，板層小體數目較多且結構正常，未觀察到細胞自噬小體，見圖3。

4 各組細胞RT-PCR檢測結果

與 Con 組相比，其余 4 組細胞的 AMPK、beclin 1和LC3 mRNA 表達均顯著增多，mTOR 和P62 mRNA表達顯著減少（P＜0.05）；與H/R、DMSO 和HX531 組相比，9-RA 組的 AMPK、beclin 1和LC3 mRNA 表達水平顯著下降，而mTOR 和P62 mRNA 表達顯著增多（P＜0.05）；H/R、DMSO 和HX531 3 組兩兩相比，各個自噬基因的mRNA 表達變化無顯著差異（P＞0.05），見圖4。

5 各組細胞Western blot檢測結果

與Con 組相比，其余4 組細胞的p-AMPK、beclin 1 和LC3-Ⅱ蛋白表達均有顯著增多，p-mTOR 和P62蛋白表達顯著減少（P＜0.05）；與 H/R、DMSO 和HX531 組相比，9-RA 組的 p-AMPK、beclin 1和LC3-Ⅱ蛋白水平顯著下降，而p-mTOR、P62 蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；H/R、DMSO 和HX531 3 組兩兩相比，各個自噬基因蛋白的表達變化無顯著差異（P＞0.05），見圖5。

討 論

肺缺血再灌注損傷作為一種機制極為復雜的病理生理過程，目前尚無特異性防治措施，但藥物預處理、抑制NF-κB 和前列腺素E1 預處理等可在一定程度上緩解LIRI［9-11］。而對于肺組織的主要效應細胞，AECⅡ的缺氧/復氧損傷可以模擬肺的缺血再灌注損傷。近年來，大量研究表明缺血再灌注（缺氧/復氧）損傷的發生發展可能受自噬相關基因（autophagy associated gene，ATG）和自噬信號通路的調控［12］。

本研究選擇了多個自噬通路上有典型指示作用的自噬相關蛋白。在自噬信號通路中，腺苷酸活化蛋白激酶（adenosine monophosphate-activated protein kinase，AMPK）和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）是上游的能量和營養感受器。當組織細胞營養缺乏時，ATP 減少而AMP增多，AMPK 活性增加，而mTOR 失活并釋放UNC-51樣激酶1（unc-51-like kinase 1，ULK1），AMPK-ULK1相互作用引起ULK1 磷酸化從而促進自噬［13-14］。Ⅱ型微管相關蛋白1 輕鏈3（microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）作為自噬的標志性蛋白，是由LC3-I轉化而來，定位于自噬體膜，故LC3-Ⅱ的蛋白水平可直接反映自噬體的數量［15］。P62 是選擇性細胞自噬程序中的關鍵蛋白，其LIR 結構域可與LC3-Ⅱ結合形成復合物，從而削弱LC3-Ⅱ在自噬體中的作用，因此P62 的表達與細胞自噬活性呈負相關關系，起到指示自噬底物降解程度的作用［16-17］。自噬相關基因6（beclin1）是重要的腫瘤抑制蛋白，在ULK1作用下，beclin 1的Ser 14位點磷酸化從而激活PI3KⅢ復合物，進而對下游自噬體的形成起到重要作用［18-19］。

Figure 2.The expression changes of RXRα and the relative cell fluorescence of RXRα in all groups.The red arrow points to the nucleus，and yellow arrow points to RXRα.Mean±SD. n=5.▲▲P＜0.01 vs Con group；##P＜0.01 vs H/R group；**P＜0.01 vs DMSO group；△△P＜0.01 vs 9-RA group.圖2 各組細胞RXRα的表達變化及熒光強度

RXR 是甾體激素受體超家族中的重要成員之一，其中又以RXRα 的研究最為廣泛［4］。RXRα 存在多種組織器官中并參與了細胞的增殖、凋亡和分化等［20］。對于組織細胞的缺氧/復氧損傷，有研究證實激動RXR 可以減輕心肌細胞缺氧/復氧損傷，其機制可能與抑制心肌細胞自噬有關［7］。因此，本研究通過運用RXR 激動劑9-RA 受體及RXR 拮抗劑HX531后，通過免疫熒光法檢測各組細胞RXRα 的表達，觀察RXR 激動劑和拮抗劑對細胞的干預效果。本研究免疫熒光結果顯示，9-RA組的RXRα表達增多，而HX531 組細胞的 RXRα 表達顯著減少，證實 RXR 激動劑和拮抗劑的確可以調整AEC Ⅱ中RXRα 的表達。

通過對AECⅡ進行缺氧/復氧、加用RXR 激動劑和拮抗劑等干預，CCK-8細胞活力檢測顯示，缺氧/復氧會引起細胞活力下降，而激動了RXR 后，細胞活力有所回升。各組細胞電鏡觀察結果也提示，除正常對照組外，其余各組細胞超微結構損傷加重，其中H/R、DMSO 和HX531 3 組細胞內可觀察到自噬小體的出現；而9-RA 組相對來說細胞損傷減輕，未觀察到明顯的細胞自噬小體。RT-PCR 與Western blot 檢測結果同樣顯示激動RXR 后細胞自噬得到一定程度抑制，而抑制RXR時細胞自噬水平上升。

Figure 3.Ultrastructure of the cells in each group under electron microscope.Yellow arrows point to mitochondria，blue arrows point to lamellar bodies，and red arrows point to autophagosomes.圖3 各組細胞電鏡超微結構

Figure 4.The mRNA expression of AMPK，beclin 1，LC3，mTOR and P62 in each group.Mean±SD. n=5.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs Con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 9-RA group.圖4 各組細胞AMPK、beclin 1、LC3、mTOR和P62的mRNA表達

Figure 5.The protein levels of p-AMPK，beclin 1，LC3-Ⅱ，p-mTOR and P62 in all groups.Mean±SD. n=5.▲P＜0.05，▲▲P＜0.01 vs Con group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs H/R group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs DMSO group；△P＜0.05，△△P＜0.01 vs 9-RA group.圖5 各組細胞p-AMPK、beclin 1、LC3-Ⅱ、p-mTOR和P62的蛋白水平

綜上所述，在本研究中通過對AEC Ⅱ進行缺氧/復氧處理并檢測相關指標，可認為缺氧/復氧成功誘導了細胞自噬的高表達，加重了細胞損傷；而用9-RA 進行干預激活RXRα 能提高細胞活性，抑制細胞自噬，減輕缺氧/復氧引起的AEC Ⅱ損傷。提示RXR可能通過抑制細胞自噬，在缺氧/復氧對AECⅡ的損傷，這為在體的肺缺血再灌注損傷防治提供了一種新的藥物干預靶點。