丹皮酚通過STAT3通路抑制IL-17A誘導的角質形成細胞活性和細胞因子分泌*

解欣然， 張 蕾， 劉 欣， 林 燕， 李 萍

（首都醫科大學附屬北京中醫醫院北京市中醫研究所，銀屑病中醫臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京100010）

銀屑病是一種自身免疫性皮膚病，主要表現為鱗屑、紅斑和點狀出血等，皮損處T 淋巴細胞浸潤與角質形成細胞異常增殖和分化是銀屑病發病的基本病理機制。輔助性T 細胞17（T helper 17 cells，Th17 cells）及其分泌的細胞因子白細胞介素17A（interleukin-17A，IL-17A）與銀屑病的發病最為密切［1］。丹皮酚是丹皮和徐長卿的主要有效成分，其藥理活性廣泛，多用于治療心腦血管、腫瘤、炎癥、變態反應及免疫系統等疾病。丹皮清熱涼血，活血散瘀，是治療銀屑病血熱證的方劑中的常用中藥之一。本研究通過IL-17A 誘導HaCaT 細胞生長，觀察丹皮酚對HaCaT 細胞的活力，細胞因子的分泌，以及信號轉導與轉錄激活因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）和細胞外信號調節激酶 1/2 （extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）的影響，探討丹皮酚治療銀屑病的作用機制。

材料和方法

1 細胞

HaCaT 細胞株（人永生化表皮細胞）購于中國醫學科學院基礎醫學研究所協和細胞資源中心。

2 主要試劑

丹皮酚購自Sigma-Aldrich；MEM 培養液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和胰蛋白酶（0.25%）購自Gibco；重組人 IL-17A 蛋白購自 PeproTech；S3I-201（STAT3 抑制劑）購自Sellckchem；CCK-8 試劑盒購自東仁化學科技（上海）有限公司；Th1/Th2/Th17 CBA（cytometric bead array）試劑盒購自 BD Biosciences；IL-23 ELISA 試劑盒購自 eBioscience；PCR 引物由上海生工生物工程有限公司合成；cDNA 第1 鏈合成試劑盒和Real Super Mixture 試劑購自北京康為世紀生物科技有限公司；兔抗 STAT3、p-STAT3，ERK1/2 和p-ERK1/2 多克隆抗體購自CST；其他生化試劑均為國產分析純。

3 主要儀器

酶聯免疫測定儀（Thermo）；3-18K 臺式高速冷凍離心機（Sigma）；倒置顯微鏡（Olympus）；ABI 7500 熒光定量 PCR 儀（Applied Biosystems）；流式細胞儀（BD）；凝膠電泳成像系統（Tanon）；半干轉電泳槽、電泳儀（Bio-Rad）；Mini P-4 電泳槽和濕轉電泳槽（Cavoy）。

4 主要方法

4.1 細胞培養 HaCaT 細胞用含 10% FBS，1×105U/L 青霉素、1×105U/L 鏈霉素的 MEM 培養液，在37 ℃、5% CO2、飽和濕度條件下培養。將 HaCaT 細胞以1×108/L 接種于細胞培養板（瓶），細胞融合近80%時進行實驗。

4.2 CCK-8 法測定細胞活力 將HaCaT 細胞接種于96 孔板，實驗分組如下：（1）空白對照（control）組：無血清培養液；（2）模型（model）組：IL-17A 200 μg/L；（3）丹皮酚高劑量（paeonol 200 mg/L）組：paneonol 200 mg/L+ IL-17A 200 μg/L；（4）丹皮酚中劑量（paeonol 100 mg/L）組：paneonol 100 mg/L+ IL-17A 200 μg/L；（5）丹皮酚低劑量（paeonol 50 mg/L）組：paneonol 50 mg/L+ IL-17A 200 μg/L，每組設 8 個平行孔。細胞與藥物共同作用24 h 后，進行指標檢測。實驗結束后，棄去培養上清，加入100 μL無血清培養液和10 μL CCK-8 溶液，孵育 2 h 后在酶標儀 450 nm 處檢測吸光度（A）值，并計算藥物抑制率，抑制率（%）=（模型組A值-給藥組A值）/模型組A值×100%。

4.3 CBA 法檢測Th1/Th2/Th17 細胞因子 吸取各組細胞上清，應用流式細胞儀檢測Th1/Th2/Th17 類細胞炎癥因子的水平，包括γ 干擾素（interferon-γ，IFN-γ）、IL-10、IL-17A、IL-4、IL-6、IL-2 和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α），操作按 CBA 試劑盒說明進行。

4.4 ELISA 法檢測細胞因子IL-23 HaCaT 細胞接種于培養板，丹皮酚設200 mg/L 和100 mg/L 劑量組，每組設4 個平行孔。細胞與藥物共同作用24 h。實驗結束后，分別吸取培養上清，3 000 r/min 離心10 min，應用ELISA 法檢測細胞分泌的IL-23，操作按試劑盒說明進行。

4.5 Real-time PCR 法檢測細胞因子和STAT3 的mRNA 表達 Trizol 法提取細胞總RNA，使用逆轉錄酶進行逆轉錄，得到相應的cDNA，以β-actin 為內參照，用Ultra SYBR Mixture 進行擴增，檢測炎癥細胞因子IL-23 和IL-6、趨化因子配體2［chemokine（C-XC motif）ligand 2，CXCL2］、CXCL8 和趨化因子配體20［chemokine （C-C motif） ligand 20，CCL20］和STAT3 的mRNA 表達。引物見表1。反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s、60 ℃ 60 s，45 個循環。實驗結果以 Ct 值反映基因 mRNA 含量，采用 2-ΔΔCt相對定量法進行組間比較。

4.6 Western blot法檢測STAT3和ERK1/2的蛋白水平 HaCaT 細胞接種于培養板，實驗分組同4.2，并加入陽性對照藥物STAT3抑制劑（S3I-201 36 mg/L）。24 h 后收集細胞提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度，取10 μg 蛋白樣本，經 SDS-PAGE 后，轉膜，用 3% 牛血清白蛋白封閉，分別加入相應抗體STAT3（1∶2 000）、p-STAT3（Tyr705）（1∶1 000）、ERK1/2（1∶4 000）和 p-ERK1/2（Thr202/Tyr204）（1∶2 000），4 ℃孵育過夜。用 TBST 洗膜×5 次，每次 3 min，加入相應Ⅱ抗，室溫孵育 1 h，TBST 洗膜 6 次，每次 3 min。ECL 加到膜上后反應3～5 min，膠片曝光5～10 min（曝光時間隨不同光強度而調整），顯影2 min，定影。實驗結果用目的蛋白條帶吸光度值/GAPDH條帶吸光度值表示。

表1 real-time PCR引物序列Table 1.The sequences of the primers for real-time PCR

5 統計學處理

用SPSS 22.0 統計軟件進行分析，實驗數據均采用均數±標準差（mean±SD）表示，方差齊性用單因素方差分析（one-way ANOVE），多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統計學意義。

結 果

1 丹皮酚對IL-17A刺激的HaCaT細胞活力的影響

IL-17A（200 μg/L）作用于HaCaT 細胞24 h 能夠顯著增加細胞的活力（P＜0.05）；100 mg/L 和200 mg/L 丹皮酚對細胞的活力呈現出顯著的抑制作用（P＜0.05），對細胞活力的抑制率分別為28.81% 和45.76%，其藥效作用具有劑量依賴性，見表2。

表2 丹皮酚抑制IL-17A誘導的HaCaT細胞活力Table 2.The HaCaT cell viability induced by IL-17A was inhibited by paeonol（Mean±SD. n=8）

2 丹皮酚對IL-17A 刺激的HaCaT 細胞分泌細胞因子的影響

應用CBA 法檢測Th1/Th2/Th17類細胞相關炎癥因子的水平，結果顯示，在IL-17A 刺激HaCaT 細胞24 h 后，在細胞上清中（除刺激劑IL-17A 外）僅測到IL-6 的分泌，并且其在模型組的含量升高，而丹皮酚能夠抑制 HaCaT 細胞分泌 IL-6（P＜0.05）；其它細胞因子含量較低，未被檢測到。同時，ELISA 結果顯示，IL-17A 刺激的HaCaT 細胞分泌IL-23 含量顯著升高，丹皮酚各劑量組對細胞分泌的炎癥因子IL-23 呈現不同的抑制趨勢，但較模型組比較差異無統計學意義，見圖1。

3 丹皮酚對IL-17A 刺激的HaCaT 細胞內細胞因子mRNA表達的影響

與空白對照組相比，模型組細胞內趨化因子CXCL2、CXCL8和CCL20 的mRNA 表達均顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，200 mg/L和100 mg/L 丹皮酚對細胞內的上述mRNA 表達均呈現出一定的抑制作用（IL-6 除外），其中，200 mg/L 丹皮酚能夠顯著抑制CXCL2、CXCL8和CCL20的mRNA表達，見圖2。

4 丹皮酚對IL-17A 刺激的HaCaT 細胞信號轉導通路STAT3和ERK1/2表達的影響

IL-17A 刺激 HaCaT 細胞使胞內 STAT3 的 mRNA水平及磷酸化STAT3（Tyr705）表達顯著增加，100 mg/L 及 200 mg/L 丹皮酚均可抑制 STAT3 mRNA 的表達（P＜0.05），但 僅 200 mg/L丹皮酚對STAT3（Tyr705）磷酸化的抑制具有統計學意義（P＜0.05）；IL-17A 刺激后 HaCaT 細胞 ERK1/2 和磷酸化 ERK1/2（Thr202/Tyr204）蛋白水平均無顯著差異，見圖3、4。

討 論

丹皮是臨床治療銀屑病血熱證的中藥復方中的主要組成之一，丹皮酚是其主要活性成分，具有抗炎、抗腫瘤和調節免疫的作用，提示丹皮酚可能對于銀屑病的免疫細胞浸潤和角質形成細胞增殖有一定的作用。文獻報道，丹皮酚可抑制角質形成細胞生長因子（keratinocyte growth factor，KGF）刺激的Ha-CaT細胞增殖，其機制是通過阻止細胞向S期和G2/M期轉化，使細胞生長增殖停滯在G0/G1期，從而抑制銀屑病的發生［2］。丹皮酚也可通過干預microRNA-155 調控細胞因子信號轉導抑制因子1（suppressor of cytokine signaling 1，SOCS1）/STAT3 途徑來治療銀屑病［3-4］。丹皮酚還可能通過抑制c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）-絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信號通路的活化，下調人β-防御素 2（human β-defensin 2，HBD-2）的表達治療銀屑病［5］。另有針對樹突狀細胞（dendritic cells，DCs）的研究顯示，丹皮酚可通過抑制Toll 樣受體7/8（Toll-like receptor 7/8，TLR7/8）通路中的MyD88 和TLR8，從而抑制DCs 細胞成熟和激活，以減輕咪喹莫特誘導的小鼠銀屑病樣皮損［6-7］。

Figure 1.The results of HaCaT cells secreted cytokines inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖1 丹皮酚抑制HaCaT細胞分泌炎癥細胞因子

Figure 2.The mRNA expression of cytokines in the HaCaT cells was inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖2 丹皮酚抑制HaCaT細胞內細胞因子的mRNA表達

Figure 3.The mRNA expression of STAT3 in the HaCaT cells was inhibited by paeonol.Mean±SD. n=4.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖3 丹皮酚抑制HaCaT細胞內STAT3的mRNA表達

Figure 4.The protein levels of STAT3 and ERK1/2 in the HaCaT cells were inhibited by paeonol.Mean±SD.n=3.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs model group.圖4 丹皮酚抑制HaCaT 細胞STAT3 和ERK1/2 蛋白水平的比較

銀屑病具有多基因遺傳背景，涉及到免疫、炎癥、細胞增殖與凋亡、神經遞質等多方面因素。銀屑病發病機制尚無定論，目前普遍認為其發生發展是免疫系統失衡和角質形成細胞異常共同作用的結果。Th17 細胞及其分泌的IL-17 在銀屑病發病中起重要作用。Th17細胞成熟分化是由STAT3和視黃醇類核內受體 γt（RAR-related related orphan receptor γt，RORγt）共同介導的，主要產生IL-17A 和IL-17F，這兩種細胞因子與自身免疫性和炎癥性疾病的發生密切相關。Th17 細胞分化由轉化生長因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）與 IL-6 首先啟動，隨后自分泌產生IL-21 擴大其分化規模，激活STAT3，IL-23則在分化后期維持Th17細胞穩定和分化成熟，從而誘導角質形成細胞的異常增殖和分化，表現出銀屑病的病理特征［8］。IL-23可以介導STAT3磷酸化過程，使STAT3 激活從而促進Th17 類細胞因子的分泌。IL-17 可以促進角質形成細胞產生血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和IL-23 等細胞因子［9］，從而再進一步刺激 Th17 細胞分泌。在銀屑病皮損的角質形成細胞中，STAT3 表現為結構性激活，導致炎癥細胞的浸潤和斑塊的形成［10］。

本實驗結果表明，IL-17A（200 μg/L）刺激體外培養的HaCaT 細胞24 h 后，能夠增強細胞的活力，使趨化因子CXCL2、CXCL8和CCL20的分泌增多，并能促進STAT3 磷酸化。丹皮酚為晶體化學物，水溶性差，用0.1%DMSO 溶解后，加入到正常培養的HaCaT細胞中，通過實驗證實200 mg/L 濃度以下丹皮酚無細胞毒作用。丹皮酚（50～200 mg/L）對于IL-17A 刺激的HaCaT 細胞的活力有一定的抑制作用，且呈劑量依賴性。

采用CBA 方法檢測Th1/Th2/Th17 類細胞因子，只有IL-6 被檢測到且于IL-17A 刺激后顯著升高，提示IL-17A刺激的HaCaT細胞分泌的炎癥因子IL-6分泌較多，其它細胞因子分泌較少，并且丹皮酚能夠抑制IL-6 的分泌，但是，IL-6 的mRNA 表達增加不受影響，即丹皮酚可能在IL-6 轉錄后發揮作用。文獻報道，IL-6 是IL-17 產生的關鍵激活劑，在銀屑病患處皮損中mRNA 和蛋白質水平上都呈高表達［11］。相反地，由記憶T 細胞釋放的IL-17 僅減少IL-6 mRNA 的降解，但對IL-6基因的轉錄無影響。IL-17 主要對IL-6 進行轉錄后調節，增強IL-6 對次級刺激的反應，而對于它自身只是一種較弱的促炎反應［12］。較高水平的IL-6可能會通過DCs和相關的Th17細胞傳遞抗原呈遞信號。由巨噬細胞、T細胞和角質形成細胞產生的其它IL-6 增強病變皮損中富含IL-6 的微環境，從而刺激記憶/效應T 細胞群中STAT3 的磷酸化激活。丹皮酚對IL-6 蛋白水平抑制作用能夠進一步阻止Th17 細胞分泌IL-17A。丹皮酚對IL-17A 誘導的HaCaT 細胞分泌的IL-23 mRNA 和蛋白表達均有一定的抑制作用。IL-23是Th17途徑的關鍵上游因子，在銀屑病皮損中呈高表達，并且是維持Th17 細胞的重要細胞因子。盡管IL-23 主要由樹突狀細胞分泌，但在銀屑病皮損中角質形成細胞也分泌IL-23［13］。IL-17 刺激HaCaT 細胞分泌IL-23，可以驗證IL-23/Th17 軸在該細胞模型的環路形成。由此可見，丹皮酚對IL-23/Th17 軸具有直接作用，并通過抑制IL-23的分泌對銀屑病發揮治療作用。

IL-17 作用 HaCaT 細胞 24 h 后，細胞內趨化因子CXCL2、CXCL8和CCL20 mRNA 表達顯著升高，200 mg/L丹皮酚對高表達的趨化因子均有顯著的抑制作用。銀屑病患處皮損中角質形成細胞是CXCL2的主要來源，CXCL2 與主要表達于單核細胞表面的趨化因子受體CCR2 結合后，單核細胞向巨噬細胞分化，從血流向炎癥部位遷移。這個過程會導致斑塊的形成［14］。同時，CXCL2 也參與角質形成細胞的增殖和新血管形成。CXCL8或IL-8可維持中性粒細胞的聚集［15］。促炎細胞因子如 TNF-α，IL-1，IL-17和IFN-γ能顯著刺激角質形成細胞中CCL20 的產生［16］。CCL20 在正常皮膚的角質形成細胞和內皮細胞中低水平表達，在銀屑病皮損表皮細胞基底層呈高表達。此外，CCR6+Th17 細胞可促進CCL20 分泌，引起更多的CCR6+Th17 細胞募集［17］。由此可見，丹皮酚可通過抑制趨化因子 CXCL2、CXCL8和CCL20 阻止 T 淋巴細胞、嗜中性粒細胞和樹突狀細胞的聚集來抑制炎癥。丹皮酚抑制趨化因子的作用可能成為銀屑病治療的一個研究方向。

STAT3 和ERK1/2 作為細胞增殖的重要細胞內信號通路蛋白，可被IL-17 激活，在銀屑病角質形成細胞增殖中發揮重要作用［18］。本研究結果顯示，丹皮酚對HaCaT 細胞內STAT3 mRNA 和蛋白表達有顯著的抑制作用，對STAT3 蛋白磷酸化的抑制作用尤為顯著，與STAT3 抑制劑的作用一致。STAT3 信號通路與細胞的生長、增殖和凋亡相關，STAT3 的持續活化可導致異常的細胞增殖和惡性轉化。在銀屑病中STAT3 磷酸化激活是特異性的，磷酸化STAT3 是Th17 細胞分化和 IL-17 分泌的關鍵轉錄因子［19］。咪喹莫特誘導的STAT3 轉基因小鼠銀屑病樣皮損紅斑、鱗屑、浸潤較單純咪喹莫特誘導的小鼠顯著加重，提示STAT3在銀屑病發病機制中的重要作用［20］。但是，丹皮酚對ERK1/2 和p-ERK1/2 的表達無顯著作用，這表明丹皮酚可能通過STAT3磷酸化途徑-IL-23/Th17軸減輕銀屑病癥狀。

綜上所述，丹皮酚能夠抑制IL-17A 刺激的Ha-CaT 細胞的活力，抑制細胞因子IL-23 和IL-6 的分泌和趨化因子CXCL2、CXCL8和CCL20的mRNA 表達，以及STAT3的mRNA和蛋白表達。