游泳運動對大鼠實驗性子宮內膜異位癥的影響及機制分析*

景彥林， 楊修昭， 白振軍， 賀千里

（1山西大同大學中醫藥健康服務學院，2大同市第五人民醫院，山西大同037009）

子宮內膜異位癥（endometriosis，EM）以子宮腔外子宮內膜組織生長為特征，常見癥狀是痛經、性交困難、慢性盆腔疼痛和不孕。證據表明，子宮膜異位癥是由周期性出血的異位子宮內膜植入物導致［1］。因此，免疫因子可能與異位內膜細胞的生長和著床有關。而內環境變化可能影響炎癥的發展和維持，從而與子宮內膜異位癥發生過程相關［2］；另一方面，體育鍛煉似乎對涉及炎癥過程的疾病具有保護作用，如2型糖尿病和結腸癌［3］。體育鍛煉也可增加某些激素結合球蛋白水平，降低雌激素生物利用度，并有益于雌激素依賴性疾病患者，如子宮內膜異位癥患者［4］。此外，長期體育鍛煉可使胰島素抵抗降低，月經減少及具有抗炎特性的細胞因子增加［5］。盡管有證據表明體育鍛煉對治療子宮內膜異位癥有益處，但迄今為止，文獻中還未報道游泳運動能否預防子宮內膜異位癥的發生或發展。因此，本項工作主要觀察游泳運動對大鼠實驗性子宮內膜異位癥的影響，并對其機制進行探討。

材料和方法

1 動物

80 只SPF 級雌性SD 大鼠（4 周）購于山西醫科大學動物中心［SCXK（晉）2015-0001］，體重80～90 g。大鼠存放在12 h 光照和12 h 黑暗清潔環境中，溫度為（22±1）℃，自由進食和飲水。80只大鼠隨機分為8組：對照組、模型組（0組）、子宮內膜異位癥誘導前輕度運動（light exercise，L-ex）組（每周游泳1 次）、中度運動（moderate exercise，M-ex）組（每周游泳3 次）和劇烈運動（intense exercise，I-ex）組（每周游泳5 次）及子宮內膜異位癥誘導后輕度運動組（每周游泳1次）、中度運動組（每周游泳3 次）和劇烈運動組（每周游泳5次），每組均為10只大鼠。

2 實驗儀器和試劑

PCR 儀（ABI）；RNA 提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，FAS）、基質金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase 9，MMP9）和增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）抗體（Santa Cruz）；ELISA 檢測試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；基因特異性引物由上海生工生物科技公司合成。

3 方法

3.1 大鼠子宮內膜異位癥模型的制備 于造模前24 h，在大鼠皮下注射外源性雌激素乙烯雌酚0.1 mg/kg，促使大鼠子宮內膜處于同一變化周期。以戊巴比妥鈉麻醉大鼠，將大鼠仰臥固定于手術臺上，沿腹中線剪開腹壁和腹膜（切口大約2～3 cm），進腹后在膀胱背側找到大鼠“Y”字型子宮，游離子宮右側，用絲線在近端離右子宮角1 cm 處結扎，遠端離卵巢約2 cm 處結扎，同時結扎兩端間的子宮系膜血管。剪取靠近卵巢處約1.5 cm 子宮置入含生理鹽水培養皿中，肌層與子宮內膜層分離后，將內膜剪成5 mm×5 mm 大小與腹壁肌肉縫合固定［6］，如圖1 所示。最后向大鼠腹腔撒少許青霉素鈉，分層關閉腹腔，縫合切口。手術結束后每天腹腔注射青霉素，連續1周。術中無異常表現，術后造模大鼠無感染及死亡。4 周后再次開腹，觀察建模是否成功，成功標準：移植灶體積增大，呈透明結節狀或囊狀，移植物被結締組織覆蓋并有血管形成。造模成功率大約為70.0%。用游標卡尺測量移植物病灶面積=長（mm）×寬（mm）。

Figure 1.Preparation of endometriosis model in rats.圖1 大鼠子宮內膜異位癥模型制備

3.2 游泳運動 有氧運動選擇游泳，因為大鼠具有天生的游泳能力，并能很好地適應訓練，因此游泳對大鼠來說壓力較小。大鼠造模成功后24 h開始游泳適應，大鼠首先在0.9 m× 0.9 m×1.2 m 水箱中適應5 d。第1 天，將動物置于溫度為34℃的5 cm 深水中15 min，然后水位持續升高，第5 天水位升高至50 cm，均不會沉底表明適應完成。然后開始有氧運動，游泳運動持續5 周，運動強度逐漸增加，從第1 周20 min 開始，到第5 周60 min 結束，運動后大鼠的主動運動減少。

3.3 樣本收集及病變大小評估 運動結束后，采用戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉大鼠，收集5 mL 血液，用于氧化應激分析。然后打開盆腔，切除子宮內膜異位癥病變部位進行組織學和基因表達分析。對側子宮角（左角）也作為對照切除。樣本固定在10%甲醛中，石蠟包埋處理，蘇木精染色，確認異位子宮內膜組織的存在。為了計算病變面積的變化，再次用游標卡尺測量造模后運動組移植物病灶面積大小。

3.4 RT-qPCR 首先取大鼠異位子宮內膜總RNA，然后進行反轉錄反應，使用FAS、PCNA 和MMP9 特異性引物進行RT-qPCR 擴增。引物序列如下：FAS的上游引物序列為 5'-CAAGGGACTGATAGCATCTTTGAGG-3'，下游引物序列為5'-TGTGAAAGTCCTGAACCCTAAGG-3'；MMP9 上游引物序列為 5'CCTGGAGACCTGAGAACCAATC-3'，下游引物序列為5'CCACCC GAGTGTAACCATAGC-3'；PCNA 上游引物序列為5'-GGAAATGGAAACATTTTAAATTGTCAC-3'，下游引物序列為5'-GAGTGGCTTTTGTAAAGAAGTTCAG-3'；β-actin 上游引物序列為5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游引物序列為5'-AACGCTTOACGAATTTGCGT-3'。通過分析軟件得到每組的Ct，其中β-actin作為內參照；參照文獻報道的方法［7］，用 2-ΔΔCt法比較不同處理后基因相對表達的含量。

3.5 Western blot 提取各組大鼠異位子宮內膜蛋白，取 30 μg 進行 SDS-PAGE，然后轉至 PVDF 膜上。經5%牛奶孵育1 h 后，用磷酸鹽緩沖液洗膜3 次，每次 10 min。用兔源 FAS、MMP9和PCNA（1∶1 000）4℃孵育3 h，PBST洗3次，每次10 min。用PBST稀釋山羊抗兔和山羊抗鼠的Ⅱ抗（1∶25 000），室溫孵育1 h。PBST 洗3 次，每次5 min。利用化學發光掃描系統檢測蛋白表達并攝片，采用Quantity One 圖像分析軟件對吸光度積值進行分析。

4 統計學處理

采用SPSS 21.0 統計軟件進行分析，數據以均數±標準差（mean±SD）表示，組間比較采用單因素方差分析及Tukey's 檢驗。以P＜0.05 為差異有統計學意義。

結 果

1 各組大鼠病變大小比較

子宮內膜異位病變誘導前的游泳運動對子宮內膜異位癥無預防作用，而誘導病變后的運動無論頻率如何（每周1次或每周5次），均可顯著降低子宮內膜異位癥的病變大小（P＜0.05）；與每周運動1 次大鼠相比，以中等（每周3次）或劇烈（每周5次）運動的大鼠病變顯著減小（P＜0.05），見圖2和表1。

Figure 2.The effect of swimming on endometriosis.圖2 模型制備后游泳對異位病灶的影響

表1 各組大鼠異位病灶面積比較Table 1.Comparison of total lesion areas in differenr groups（mm2.Mean±SD. n=10）

2 各組大鼠相關基因mRNA表達的比較

如表2 所示，誘導子宮內膜異位癥后進行中度或劇烈游泳運動的大鼠子宮內膜FAS mRNA 表達均顯著增加（P＜0.05）；而誘導子宮內膜異位癥后進行中度或劇烈游泳運動的大鼠MMP9 mRNA 均顯著降低（P＜0.05）。

表2 各組FAS、MMP9和PCNA mRNA表達Table 2.The mRNA expression of the FAS，MMP9 and PCNA at the end of the experimental protocol（Mean±SD. n=10）

3 各組大鼠相關蛋白表達比較

Western blot 結果進一步證實，誘導子宮內膜異位癥后進行中度或劇烈游泳運動的大鼠其子宮內膜FAS 蛋白顯著增加（P＜0.05）；而誘導子宮內膜異位癥后進行中度或劇烈游泳運動的大鼠其子宮內膜MMP9和PCNA 蛋白均顯著降低（P＜0.05），見圖 3和表3。

Figure 3.Western blot was used to detected the protein levels of FAS，MMP9 and PCNA at the end of the experimental protocol.圖3 FAS、MMP9和PCNA的Western blot結果

表3 各組FAS、MMP9和PCNA蛋白表達Table 3.Expression of the FAS，MMP9 and PCNA proteins at the end of the experimental protocol（Mean±SD. n=5）

討 論

以往研究已經證實，規律體育鍛煉對炎癥相關疾病的患者具有保護作用［8］。近年研究發現，橫紋肌具有內分泌功能，通過合成和釋放收縮刺激心肌細胞因子，從而影響和改變組織和器官中的代謝及細胞因子產生［9］。對現有文獻數據的分析表明，游泳運動能否預防子宮內膜異位癥的發生或發展，以及游泳運動在多大程度上對子宮內膜異位癥患者有益，仍不明確。由于對子宮內膜異位癥的研究往往需要采用侵入性方法，這限制了其在臨床上的應用，因此必須使用動物模型進行研究［10］。在此背景下，開海麗等［11］提出的大鼠子宮內膜異位癥誘導實驗模型廣泛應用于相關研究，可有效地誘導病變，并具有高度的可重復性。此外，大鼠具有天生的游泳能力，能很好地適應訓練［12］。基于這些原因，因而本研究通過游泳作為體育鍛煉來評估其對子宮內膜異位癥模型大鼠的影響。本研究結果表明，誘導大鼠子宮內膜異位癥后，游泳運動至少在一定程度上有益于子宮內膜異位癥的治療，無論運動頻率如何（每周1次或每周5 次），而大鼠子宮內膜異位癥模型制備前的游泳運動對子宮內膜異位癥的治療無任何影響。因而本研究主要關注的是大鼠子宮內膜異位癥模型制備后的游泳運動。

正常子宮內膜細胞凋亡呈周期性變化。本研究結果顯示，在子宮內膜異位癥誘導后進行游泳運動的大鼠FAS mRNA 水平顯著增加。FAS 屬于腫瘤壞死因子受體和神經生長因子受體超家族成員之一，是一種Ⅰ型跨膜糖蛋白。細胞在接收到經FAS 傳遞的凋亡信號后，主要通過外源性凋亡途徑和內源性凋亡途徑引發細胞凋亡［13］。子宮內膜異位癥患者異位內膜功能活躍，黏附、侵襲、血管增生能力強，使其易于遷徙和種植，而凋亡相關基因的表達并不隨月經周期出現波動，導致患者在位和異位內膜細胞對凋亡信號的敏感性減弱［14］，而游泳運動可使FAS mRNA 及蛋白水平增加，因而異位子宮內膜細胞凋亡增加，病變減小。本研究結果也顯示，在子宮內膜異位癥誘導后進行游泳運動的大鼠MMP9 和PCNA mRNA 水平顯著降低。此外，Western blot 結果進一步證實，誘導子宮內膜異位癥后進行游泳運動大鼠的PCNA 和MMP9 蛋白降低。MMP9 是金屬基質蛋白酶家族中分子量最大的明膠酶，可促進血管內皮細胞出芽，導致新生血管形成，因而其在子宮內膜細胞的異位勃附、種植和生長過程中發揮重要作用［15］。因而MMP9 蛋白水平降低可使子宮內膜異位細胞的增殖、遷移和分化減少。PCNA 基因是反應細胞增殖的指標。PCNA 存在于細胞核中，是DNA 聚合酶δ的輔助蛋白，為DNA 復制所必需，可作為細胞增殖有效標志物［16］。本研究結果顯示游泳運動可使PCNA 蛋白表達降低，可抑制大鼠異位子宮內膜細胞增生。

總之，本研究結果表明，造模后游泳運動可能通過調節FAS、MMP9 和PCNA 蛋白，從而對大鼠子宮內膜異位癥發揮有益作用。