海水中汞樣品保存方法研究

陳衛衛 ，趙 恒 ，楊 穎 ，2*，楊幸幸

（1. 國家海洋局東海環境監測中心， 上海 201206；2. 自然資源部海洋生態監測與修復技術重點實驗室， 上海201206）

汞是毒性最強的重金屬污染物之一，已被我國和聯合國環境規劃署、世界衛生組織、歐盟及美國環境保護署等機構列為優先控制污染物[1]。我國汞污染環境問題較為突出，大規模的工、礦業活動，如汞冶煉、鉛鋅冶煉、混汞采金和氯堿生產等導致的局地汞污染問題非常嚴峻。排放到環境中的汞隨著河流、直排口、大氣沉降等方式進入海洋，最終影響海洋生態環境和食物鏈，因此海水中汞是監測海洋環境污染狀況的重要指標之一。一般情況下，汞在海水中的含量極低，屬于痕量元素，且穩定性差，從20 世紀70 年代以來，國內外關于水體中汞的樣品采集、保存和檢測方法的研究較多[2-8]。陸賢崑等[2]試驗了Pyrex 玻璃瓶、聚乙烯瓶、聚四氟乙烯瓶等容器，并加入不同固定劑保存ng/L 級汞的天然海水樣品，發現玻璃瓶和聚四氟乙烯瓶適合較長期保存汞樣品，聚乙烯瓶則對汞樣品有較明顯的沾污。羅偉權等[3]選擇了硝酸鉀、重鉻酸鉀和過硫酸鉀作固體保存劑，進行了海水中汞樣保存的對比實驗，發現0.1%（w/v）過硫酸鉀作保存劑效果較好，可保存3 個月；硝酸鉀不宜用作海水中汞的保存劑。潛琬英等[4]試驗了六種不同固定劑對近岸海水樣品和放置澄清的測汞海水樣品對汞的保護作用，發現所試驗的幾種試劑對未過濾的近岸海水樣品均沒有明顯的穩定作用。《海洋監測規范》（GB 17378.4-2007）[9]中要求用玻璃瓶盛裝海水中汞樣品，樣品不過濾，現場加濃硫酸至pH＜2，再加入一定量的5%（w/v）過硫酸鉀溶液，可以保存13 天。

根據前人的研究結果和標準方法，針對海水中汞監測中存在的問題，本文開展了三方面技術驗證。一是不同玻璃器皿對汞的吸附特性是否一致，選擇了常用的100 mL 普通磨口廣口玻璃瓶（簡稱“玻璃瓶”或“瓶”），與100 mL 細長棕色螺口硬質玻璃樣品管（簡稱“玻璃管”或“管”）進行試驗；二是驗證汞樣品檢測中用到的過硫酸鉀氧化劑在采樣現場添加及在試驗室檢測前添加的不同影響；三是驗證樣品保存時效。

1 材料與方法

1.1 方法與儀器

本試驗采用的分析方法為《海洋監測規范》（GB 17378.4-2007）中原子熒光法[9]，采用 PF6-2 型非色散原子熒光光度計（檢出限＜1 ng/L）。試驗用的玻璃瓶和玻璃管在使用前用相同的鹽酸溶液浸泡24 h 以上。

1.2 試驗方案

根據試驗目的設計了試驗方案，共設置5 項變量，分別為試驗容器（玻璃瓶和玻璃管）、空白檢驗、水樣基質影響（蒸餾水和海水，其中海水基體采用陳化后的遠洋海水，并經空白檢驗合格）、加入過硫酸鉀氧化劑時間以及樣品保存時間，評價各變量對測定結果的影響程度。從樣品配制完成開始，分別測定了 1 d、2 d、7 d、14 d、20 d、27 d 共 6 批次樣品。試驗樣品按如下方法制備：

（1） 分別移取 5.00 μg/L 樣品制備標準溶液4.00 mL 和 8.00 mL 于 500 mL 容量瓶，分別用蒸餾水、遠洋海水定容，配制成濃度為40.0 ng/L 和80.0 ng/L 加標樣。

（2）分別將兩種濃度的加標樣保存于玻璃瓶、玻璃管中，每個濃度包含3 個平行樣，每批次共有36個標樣，按時間順序共6 批次，樣品設置情況見表1。

（3）空白樣，使用蒸餾水和遠洋海水作空白。蒸餾水空白樣品設置3 份，2 份保存于玻璃瓶，1 份于玻璃管中，其中保存于玻璃瓶的1 份空白用于提前加入氧化劑試驗，每次測定3 個空白平行樣；空白樣品設置情況見表2。

表1 加標樣品設置類型說明

表2 空白樣品設置類型說明

1.3 樣品預處理

（1）所有樣品均加入1 mL 濃硫酸固定；

（2）其中一份遠海海水加標樣，在加入硫酸固定劑后，立即加入2.5 mL 氧化劑，制成“海水+氧化劑”樣品。同時取用玻璃瓶配制12 個空白樣，在加入硫酸固定劑后，立即加入2.5 mL 氧化劑，制成“空白+氧化劑”樣品；

（3）除空白+氧化劑、海水+氧化劑（瓶）、海水+氧化劑（管）樣品外，其余樣品均在測量前一天加入過硫酸鉀氧化劑。

1.4 評估方法

1.4.1 準確度和精密度 準確度根據《海洋監測規范》（GB 17378.2-2007）[10]中兩組數據差異性檢驗中的成對數據t 檢驗法對測定結果的回收率差異進行統計，以評價不同試驗條件測定數據的準確度。控制單一變量，將測定數據分為兩組進行成對數據t檢驗，當 t＜tɑ（0.05），差異不顯著，當 tɑ（0.05）＜t＜tɑ（0.01），差異較顯著，當 t＞tɑ（0.01），差異很顯著。成對數據 t 檢驗計算公式如式（1）。精密度根據《海洋監測規范》（GB 17378.2-2007）[10]中兩組數據差異性檢驗中的F 檢驗法對測定結果的回收率方差的齊性進行檢驗，計算公式如式（2），以評價不同試驗條件測得數據的精密度。

1.4.2 趨勢分析 統計樣品測定時間與試驗回收率的Pearson 相關系數，分析測定時間與回收率的線性相關性，判斷樣品在冷藏條件下長時間保存對測定數據準確性的影響。將不同試驗條件的6 批次數據與樣品測定時間做相關性分析，第一批次試驗時間計1 天，后續5 批次試驗時間分別為2、7、14、20 和 27 天。依據 Pearson 相關系數（r）及顯著性水平（P）判斷相關性。Pearson 相關系數（r）的計算公式如式（3），P 值是配對t 檢驗計算過程中得到的結果，用來評估相關程度計算結果的“顯著程度”。

P 值的計算是建立在如下兩個假設基礎上的：（1）無效假設 H0：兩參量間不存在“線性”關聯；（2）備擇假設H1：兩參量間存在“線性”關聯。若P＞0.05，則不能拒絕無效假設H0，說明測定時間與回收率線性相關性不顯著；若0.01＜P＜0.05，則測定時間與回收率線性相關性較顯著；若P＜0.01，則相信備擇假設H1，測定時間與回收率線性相關性很顯著；當r＞0，測定時間與回收率呈正相關，當r＜0，測定時間與回收率呈負相關，|r|越接近1，相關性越強。

2 結果與分析

2.1 試驗結果

根據試驗方案對設計的12 類樣品及內控樣、空白樣等進行測試，表3 匯總了本試驗中不同控制變量樣品及空白樣品的測定數據的平均值。表中容器列為“瓶”的意為以玻璃樣品瓶為容器，為“管”的意為以玻璃樣品管為容器。

表3 各類樣品平行測試結果平均值統計表

2.2 異常值判斷與剔除

采用《海洋監測規范》[10]中Grubbs 檢驗法和加標樣品回收率容許限值對測定結果中的異常數據進行判定。異常值剔除分為兩個步驟：

（1）采用Grubbs 檢驗法對同一方法的不同時間批次得到的18 個測量值進行一致性檢驗，根據檢驗結果，判斷3 個數據為異常值，不計入平均值的計算，分別為第4 批次玻璃瓶空白1 個，第3 批次玻璃管裝蒸餾水樣品（80 ng/L）1 個，第2 批次玻璃瓶裝海水樣品（80 ng/L）1 個。

（2）根據平行樣品測定值計算加標樣品的平均回收率，根據《近岸海域環境監測規范》（HJ442-2008），回收率容許值定為60%～120%，剔除不滿足回收率要求的12 個測量值，分別是玻璃瓶裝海水基質立即加氧化劑樣品（40 ng/L）第 3、4、5、6 批次共8 個數據，玻璃瓶裝海水基質立即加氧化劑樣品（80 ng/L）第4 和第6 批次共4 個數據，使平均回收率處于允許值范圍內。

2.3 數據歸一化

與通常回收率計算方法不同，為了對比六次測定批次間的變化情況，需使用內控結果對樣品測量值進行歸一化修正，即消除儀器響應的波動對測定結果的影響。平均回收率的計算公式如式（4）。

式中：ci為樣品汞的測量值，單位為 ng/L；csb為樣品對應容器的樣本空白測量值，單位為ng/L；crb為試劑空白測量值，單位為ng/L；cs為加入標準濃度，單位為ng/L。樣品取樣量為50 mL，在加1 mL硫酸和2.5 mL 氧化劑后，濃度會略有降低，加標濃度為40 ng/L 的樣品實際濃度約為37.4 ng/L，80 ng/L的樣品實際濃度約為74.8 ng/L。

剔除異常數據后，計算得到各組平行樣的平均回收率，如表4 所示。

表4 平行樣品平均回收率匯總

2.4 試驗變量影響分析

利用SPSS 統計分析軟件的成對t 檢驗及F 檢驗的方法對不同試驗變量的數據進行差異性檢驗，結果見表5。檢驗結果顯示：

（1）當試驗變量為試驗容器時，以海水樣品統計，t＞tɑ(0.01)且 P＜0.01，表明使用不同容器得到測量數據的準確度差異顯著，使用玻璃瓶進行的試驗回收率平均值為95.8%，高于使用玻璃管的回收率平均值約4 個百分點，可能是因為比表面積更大的玻璃管對汞吸附能力更強；Fɑ(0.05)＜F＜Fɑ(0.01)且 0.01＜P＜0.05，表明兩種條件的數據精密度差異較顯著，回收率標準偏差分析結果表明，玻璃管的回收率標準偏差略低于玻璃瓶，使用玻璃管的回收率波動更小。此外，數據處理過程中剔除的15 個異常值中，使用玻璃瓶的為13 個，使用玻璃管的僅為2 個，表明使用玻璃瓶進行試驗更易受到干擾，而玻璃管的密封性更好，使用玻璃管的試驗數據精密度較高、穩定性更強。

（2）當試驗變量為初始加標濃度時，t＜tɑ(0.05)且P＞0.05，表明不同初始加標濃度得到的回收率數據差異性不顯著，40 ng/L 和80 ng/L 的初始制備液進行試驗得到平均回收率分別為91.0%和91.3%，兩者較接近，認為準確度相同；Fɑ(0.05)＜F＜Fɑ(0.01)且 0.01＜P＜0.05，表明兩種初始加標濃度測得的數據精密度差異較顯著，初始加標濃度為40 ng/L 的回收率標準偏差要稍高于初始加標濃度為80 ng/L 的回收率。

（3）當試驗變量為不同基質時，t＞tɑ(0.01)且 P＜＜0.01，表明蒸餾水和海水作為不同基質得到的回收率數據差異性很顯著，海水基質的回收率平均值為91.9%，而蒸餾水基質的回收率平均值為84.5%，海水作為基質時的回收率明顯高于淡水基質，準確度較高。吳宏海等[11]研究表明，隨著離子強度增加，石英對Cu2+離子的吸附量逐漸減少，這是因為溶液中Na+離子與Cu2+離子競爭石英表面的帶負電的吸附位點，海水基質中的Na+離子強度明顯高于蒸餾水，因而溶液中Na+離子與玻璃容器表面吸附位點的結合能力更強，導致容器對Hg2+離子吸附減弱，進而使海水基質樣品的回收率升高；F＜Fɑ(0.05)且 P＞0.05，表明兩種基質測得的數據精密度差異不顯著。

（4）當試驗變量為是在加入硫酸固定劑后，馬上加入2.5 mL 氧化劑時，由于瓶裝樣品中共有11個樣品結果為異常值，此處采用管裝海水樣品進行統計，t＜tɑ(0.05)且 P＞0.05，表明是否立即加入氧化劑得到的回收率數據差異性不顯著，沒有立即加入氧化劑的回收率平均值為89.9%，而立即加入氧化劑的回收率平均值為91.9%，兩者較為接近，認為準確度相同；F＜Fɑ(0.05)且 P＞0.05，表明是否立即加入氧化劑測得的數據精密度差異不顯著。但是，值得注意的是，剔除的15 個異常值中，有12 個數據來自立即加入氧化劑的樣品，原因可能是立即加入氧化劑的試驗操作更容易對樣品造成玷污。

表5 回收率準確度及精密度檢驗結果

表6 檢測結果與時間序列的相關性分析

2.5 回收率變化趨勢分析

6 批次樣品測定共持續27d，將試驗時間與試驗回收率結果做線性相關性分析，以判斷樣品在長時間保存情況下，測定數據的準確性是否會受到影響。相關性分析結果如表6 所示。結果顯示，本試驗涉及的12 種變量組合條件下，分析時間與回收率之間均無顯著相關性；圖1 為不同測定時間的回收率變化情況，第2 天回收率結果整體偏低應為測定方法的系統誤差，可以通過儀器和試劑的校準予以修正。因此，可以認為不同初始條件的汞樣品在本試驗的保存條件下可長時間維持測定數據的準確性。

3 結論

本文試驗結果表明，不同保存容器和預處理方法會對不同基質的水質汞樣品的回收率產生影響，具體結論如下：

（1）對樣品測定準確度影響較大的因素為保存容器，磨口廣口玻璃瓶盛裝水樣的回收率更高，平均回收率為93.8%，高于使用細長棕色硬質玻璃管89.9%的平均回收率；但是精密度檢驗結果及異常數據分析表明使用玻璃瓶測定的數據穩定性較差，更易受到玷污。

（2）不同樣品基質也是影響回收率的重要因素。海水樣品的平均回收率為93.4%，高于蒸餾水基質的84.2%。本文試驗采用了純海水基質，但在河口區監測時，鹽度變化大，情況更復雜，還需要進一步驗證。

圖1 不同保存時間的回收率變化情況

（3）不同初始加標濃度及是否在加入固定劑后立即加入氧化劑這兩個因素對回收率沒有影響，但較低濃度樣品檢測穩定性降低，更易受其他因素影響。對于玻璃瓶采樣，立即加入氧化劑的操作可能是異常情況增加的原因之一。

（4）樣品長時間保存后的測定結果顯示，汞的回收率不會受保存時間的影響，至少在27 天內可維持測定數據的準確性。

綜上，在實際水樣監測過程中，可優先選用廣口磨口玻璃瓶作為樣品保存容器，但要注意容器的密封性，做好樣品的防玷污措施；選擇硬質螺口玻璃管時，需確認容器吸附性是否達到平衡。如果樣品需保存一段時間后測定，不必在加入固定劑后立即加入氧化劑。經預處理后的樣品可保存約1 個月。