釀酒酵母醇?；D移酶的研究進展

雍茜浩，趙 婷，劉 君，袁思棋，2，趙文鵬，張翔宇，黎 源

（1.四川輕化工大學 生物工程學院·五糧液白酒學院，四川 宜賓 644000；2.瀘州老窖集團有限責任公司，四川 瀘州 646000）

中國獨創的固態法白酒釀造，通過釀酒微生物的繁殖代謝產生的各種呈香呈味物質和健康因子，賦予了白酒獨特的香、醇、甘、美的特點，而含有眾多微生物及其產生的多種酶的釀酒微生物作為釀制傳統大曲酒的糖化劑、發酵劑與增香劑，對白酒的質量、香型起到了決定性作用[1-5]。

白酒中目前已發現的四大主要酯類是乙酸乙酯、乳酸乙酯、己酸乙酯和丁酸乙酯[6-7]。作為白酒香氣的重要來源，這四種酯類均帶有類似花香或果香的氣味。酯類物質的含量是區分白酒香型的重要因素，因此，不同香型的白酒中酯類物質的含量和比例大相徑庭（表1）[8]。其中清香型白酒和老白干香型白酒的主體香均為乙酸乙酯和適量的乳酸乙酯，但清香型白酒的乳酸乙酯與乙酸乙酯比例為1∶0.6～1∶0.8，而老白干型白酒的乳酸乙酯與乙酸乙酯比例≥1∶0.8[9]。由此可見，酯類物質對白酒香型風格的形成至關重要，酯含量和比例的不同將會影響白酒的風格特征[10-11]。

在白酒發酵過程中，由釀酒酵母催化合成的?；ヮ愇镔|眾多，本文對白酒中產酯酵母、釀酒酵母?；ズ铣赏緩街械年P鍵酶基因，包括醇?；D移酶和酯酶基因，以及其酶學性質、晶體結構學進行分析，并對酶的作用機理和機制等研究現狀進行綜述。同時，對其在中國白酒中的應用前景進行了展望。

表1 不同香型白酒中酯類物質占總酯量的比例Table 1 Proportion of esters in total esters in different flavor Baijiu

1 白酒中產酯酵母

在白酒發酵過程中，存在著多種產酯微生物，包括酵母菌、霉菌、細菌等，其中酵母菌是主要的產酯微生物[16-17]，其中包括產酯酵母類群和產酒精酵母類群[3，11]。白酒釀造過程中，產酯酵母通過代謝產生的酯類不僅是白酒重要的呈香呈味物質，其中某些酯類還被證明是白酒中對人體有益的健康功能因子[18-20]。產酯酵母又稱為生香酵母，是一大類能通過代謝產生酯類物質的酵母菌總稱，其中包括酵母屬（Saccharomyces）、假絲酵母屬（Candida）、漢遜酵母屬（Hansenula）、畢赤酵母屬（Pichia）、球擬酵母屬（Torulopsis）等[21-22]。在發酵過程中，產酯酵母菌通過吸收外界的糖分和氨基酸，將其轉化為醇、脂肪酸、輔酶等物質，通過?；D移酶合成乙酸乙酯等酯類物質[23-25]。

2 釀酒酵母酯代謝通路

釀酒大曲中早已發現并分離的產酒產香釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），是目前在食品發酵中使用最廣泛的酵母[26-27]。通過國內外學者多年的研究，釀酒酵母細胞在發酵過程中負責合成酯類化合物的各種酶及合成通路正逐步被發現。目前，已發現的酵母酯代謝通路有三條：（1）醇酰基輔酶A和醇在醇?；D移酶的催化下合成酯類[28]；（2）煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamideadeninedinucleotide，NAD+）或煙酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADP+）作為氫受體的存在條件下，醇脫氫酶將通過醇和醛親核加成反應合成的半縮醛脫氫形成酯類[29]；（3）通過脂肪酶或酯酶將醇和酸酯化成酯[30]。酵母菌醇?；D移酶來源較為廣泛，其中包括釀酒酵母、克魯維氏酵母（Kluyveromyces）、巴氏酵母（Saccharomyces bayanus）和葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）等，不同的來源其呈現出不同的酶活力和底物選擇性；目前主要報道的是釀酒酵母和葡萄汁酵母中的醇?；D移酶[31-32]。

釀酒酵母代謝產生的芳香活性酯依據成分來源分為兩類：一類是由高級醇和乙酰輔酶A為底物合成的乙酸酯，目前釀酒酵母中已發現Atf1p、Atf2p和LgAtf1p（現已從不同的酵母背景中克隆，包括啤酒酵母）三種醇?；D移酶負責催化乙酸酯的合成；另一類是由酰基輔酶A活化的中鏈脂肪酸和乙醇為底物合成的乙基酯，釀酒酵母中催化乙基酯的醇?；D移酶為Eeb1p和Eht1p[33]。釀酒酵母通過醇酰基轉移酶途徑合成乙酸酯和乙基酯的簡明合成通路見圖1[33-35]。其中，合成乙酸酯的高級醇主要包括兩個來源：一是埃利希（Ehrlich）途徑，即氨基酸通過轉氨形成α-酮酸，進而還原形成高級醇[34]；二是哈里斯（Harris）途徑，即α-酮酸來源于葡萄糖等碳水化合物的代謝，并經2-酮基酸脫羧酶和脫氫酶分別脫羧脫氫形成高級醇[35]。另外需要強調的是，α-酮丁酸不僅可以由丙酮酸代謝合成，一些氨基酸如天冬氨酸、高絲氨酸、蘇氨酸也是α-酮丁酸合成的前體物質[36]。在酒精發酵過程中，酵母菌代謝產生乙酸酯等不飽和脂肪酸以增強膜的流動性；由于中鏈脂肪酸對細胞的毒性，乙基酯的形成屬于酵母細胞一種自我保護機制，兩種酯類物質的產生受酵母細胞控制互不影響。

圖1 釀酒酵母醇?；D移酶途徑合成乙基酯和乙酸酯類物質通路Fig.1 Synthesis pathway of ethyl esters and acetate esters by alcohol acyltransferase pathway in Saccharomyces cerevisiae

2.1 醇酰基轉移酶Atf1p、Atf2p和LgAtf1p負責釀酒酵母乙酸酯的合成

2.1.1 醇?；D移酶Atf1p、Atf2p的來源、分布和序列信息

1993年，MINETOKI T T等[37]首次通過多次色譜純化，在釀酒酵母的微粒體組分中獲得醇酰基轉移酶Atf1p，該蛋白分子質量大小為61.1 kDa，編碼525個氨基酸；ATF1基因的同源基因Lg-ATF1隨后也在Saccharomyces uvarum中被發現[38]，但是對于該基因目前尚無具體研究。釀酒酵母醇酰基轉移酶Atf1p與其他酵母如假絲酵母（Candida）、巴氏酵母和乳酸克魯維氏酵母的?；D移酶序列比對顯示2個潛在的必需區域：WRLICLP基序和ATF1基因編碼的198～202位氨基酸表達的高度保守的HXXXD區域[39]；醇?；D移酶Atf1p C端與N端的兩親性螺旋，決定了醇?；D移酶Atf1p在內質網中與脂滴的結合[40-41]；ATF2基因由NAGASAWA N T等[42]于1998年成功克隆。細胞低表達量的醇酰基轉移酶Atf2p含535個氨基酸，分子質量大小為61.9 kDa，與ATF1基因序列相似度為36.9%，也被認為是內質網膜蛋白[31，41，43]。Atf2p的C端與N端的兩親性螺旋，決定了醇?；D移酶Atf2p在內質網中與脂滴的錨定[41-42]。

通過對釀酒酵母ATF1基因進行無義突變發現，ATF1基因無義突變酵母仍能保留40%乙酸乙酯和75%苯乙酸乙酯的合成能力，但乙酸異戊酯合成能力大幅降低，降低80%，確定醇?；D移酶Atf1p主要負責釀酒酵母細胞中異戊醇酰輔酶A的轉移，并催化乙酸異戊酯的生物合成[44-45]；而基因ATF1與ATF2雙敲除釀酒酵母則完全不合成乙酸異戊酯，證明了基因ATF1和ATF2參與了釀酒酵母細胞所有的乙酸異戊酯催化合成，同時也說明乙酸異戊酯的生物合成由醇?；D移酶Atf2p與Atf1p共同催化[31，46]。

2.1.2 醇?；D移酶Atf1p、Atf2p的酶學性質、調控機制與生理功能

通過ATF1基因的克隆表達[38，47]、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）[38，47]和生理生化檢測[38，47]等試驗表明，其中ATF1基因的表達量較低，且醇酰基轉移酶Atf1p的催化活性能被多種重金屬離子（Cd2+、Cu2+、Zn2+、Hg2+）和巰基試劑抑制[37]；異戊醇為催化限制因子，通風、非飽和脂肪酸的加入均可抑制Atf1p的活性[47]。生化實驗表明，醇?；D移酶Atf2p也具有廣泛的?；D移酶的活性，但比酶活只有醇酰基轉移酶Atf1p的50%，然而非飽和脂肪酸不能完全抑制醇?；D移酶Atf2p的酶活[42，48]。醇酰基轉移酶Atf1p能催化多種酯的合成，但更傾向于使用長鏈醇和直鏈醇作為合成底物[47]；醇酰基轉移酶Atf1p對溫度敏感，這可能與醇?；D移酶Atf1p中含14個半胱氨酸有關[41，47]；醇酰基轉移酶Atf1p體外實驗顯示出額外的硫酯酶活性，且在HXXXD區域中組氨酸的突變無法完全消除該活性[37-41，47，49]。

ATF1基因5'端上游堿基長度約150 bp的基因序列參與了醇?；D移酶Atf1p的表達調控，已完全闡明的調控機制包括缺氧抑制因子阻遏物Rox1p及阻遏復合物Tup1p-Ssn6p（Rox1p-Tup1p-Ssn6p）復合物對ATF1基因在富氧環境下的表達抑制、富氮環境下通過蛋白質激酶Sch9p激活培養基誘導的發酵生長（fermentable-growth-medium-induced，FGM）通路與下游的Rap1p蛋白來調控ATF1基因的轉錄、以及葡萄糖能通過Ras-cAMP/PKA信號通路（ras-protein kinase a pathway，Ras/cAMP/PKA）誘導無氧條件下碳源饑餓的釀酒酵母細胞的ATF1基因表達[50-51]。

基于上述調控機制，VERSTREPEN K J等[51]提出醇?；D移酶Atf1p的生理功能可能是通過酯化某些膜組分的游離羥基，以優化在環境壓力下的膜的性質。醇?；D移酶Atf2p的生理功能見圖2，功能性獲得和缺失突變實驗結果顯示醇酰基轉移酶Atf2p與錨定在細胞膜上的脫乙酰酶Say1p共同維持甾醇的穩態；脫乙酰酶Say1p決定了?；溺薮际欠穹置谝约笆欠衩擋；减；D移酶Atf2p則決定了甾醇荷爾蒙毒性前體如孕烯醇酮的?；c分泌，二者在3-β-羥基類固醇的解毒過程中發揮了重要作用[52-53]。

圖2 醇?；D移酶Atf2p的生理功能Fig.2 Physiological functions of alcohol acyltransferase Atf2p

2.2 醇?；D移酶Eeb1p和Eht1p負責釀酒酵母乙基酯的合成

2.2.1 醇酰基轉移酶Eeb1p和Eht1p來源、分布和序列特征

由于在ATF1和ATF2雙缺失基因中仍能檢測出與出發菌株等量的乙基酯[31]，MASON A B等[54]提出第四種酯合成酶，乙醇己酰基轉移酶Eht1p，負責催化乙醇和己?；?輔酶A生成己酸乙酯。SAERENS S M G等[55]于2006年報道了來自三成員基因家族的YBR177c/EHT1、YPL095c/EEB1和YMR210w基因，并證明了Eht1p和Eeb1p這兩種醇酰基轉移酶：醇-O-?；D移酶（acyl-CoA ethanol O-acyltransferases，AEATases）催化酵母中大多數的酰基輔酶A和乙醇合成中鏈脂肪酸乙基酯，但是第三個家族成員Ymr210w在中鏈脂肪酸乙酯的形成中不發揮重要作用。

1999年，ATHENSTAEDT K等[56]研究發現，醇?；D移酶Eht1p存在于脂質顆粒中[57]。該脂質顆粒由高度疏水的核心組成，核心則由中性脂質（三?；视秃顽薮减ィ┬纬?，脂質顆粒周圍被磷脂單層包圍，在磷脂層中僅嵌入了少量跨膜蛋白質。脂質顆粒用作能量來源和/或作為膜生物發生所需的脂肪酸和固醇的來源。與野生型菌株相比，EHT1基因高表達菌株含有更高含量的三?；视秃顽薮减?，然而Eeb1p的細胞定位暫時不確定[56]。

基因EEB1和EHT1的堿基長度分別為1 356 bp，1371 bp，其同源性＞99.7%，分別編碼451個氨基酸和456個氨基酸，分子質量分別為51.2 kDa、51.7 kDa，編碼蛋白序列的同源性為57.68%，屬于同一家族，其N端145個氨基酸非常相似，但目前還沒有鑒定出二級結構，C端含有α/β水解酶折疊位點[55]。

SAERENS S M G等[55，58]預測Eht1p和Eeb1p蛋白含有酯化反應的關鍵催化域（Ser-Asp-His），其被認為是醇?；D移酶的催化位點，即底物結合位點，其結構預測結果中得到催化三聯體（Ser-Asp-His）見圖3[55]，該催化三聯體負責酯交換反應，使這兩種蛋白具有酯合成酶和酯酶活力；Eht1p蛋白的催化位點分別位于Ser-247、Asp-395、His-423，而Eeb1p蛋白的催化位點位于Ser-251、Asp-399、His-428。

圖3 Eht1p催化三聯體三維結構Fig.3 Three-dimensional structure of Eht1p catalytic triad

2.2.2 醇?；D移酶Eeb1p和Eht1p酶學性質及生理功能

關于合成乙基酯的關鍵酶，目前仍然存在爭議。Eeb1p和Eht1p酶的含量影響己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的生成，是酵母代謝控制中短鏈脂肪酸乙基酯合成的關鍵酶[59-60]。對從食源性物質中分離得到的酵母菌株進行產香揮發性成分檢測，發現其中包含多種酯類物質如辛酸乙酯和己酸乙酯等[61]。FUKUDA K等[62]通過分析已篩選的酵母中控制酯類合成的酶，發現EHT1基因是酵母中合成中鏈脂肪酸的關鍵基因，并且有短鏈酯酶活力；通過檢測EHT1和EEB1基因的分布情況時發現EHT1基因在所有菌株中均存在，而EEB1基因只在部分酵母菌株中存在，推測EHT1基因可能是酵母合成酯類物質的重要基因之一，同樣也反映出EEB1基因是釀酒酵母的非必需基因[62]。而SAERENS S M G等[55]將敲除部分片段的菌株與野生菌株相比較發現，EEB1基因的缺失的菌株會導致丁酸乙酯、己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯的含量大幅降低；而EHT1基因的缺失的菌株僅會導致己酸乙酯和辛酸乙酯的少量減少；當兩個基因雙缺失時產生的乙酯的量和基因EEB1缺失時產生量相差無幾，這表明在生成中鏈脂肪酸乙基酯的過程中，Eht1p僅起次要作用，而Eeb1p起主要作用，這與上述FUKUDA K等[62]的觀點不同。

SAERENS S M G等[55]研究發現，醇?；D移酶Eht1p更大程度的控制了短鏈脂肪酸酯的合成，由醇?；D移酶Eht1p催化形成的丁酸乙酯的含量是已酸乙酯的4倍；而醇?；D移酶Eeb1p偏好利用辛酰輔酶A，是催化中鏈乙酯的主要酶；另外，當兩個基因表達都受到抑制時，體內仍然檢測到中鏈脂肪酸乙酯，推測在釀酒酵母內還存在有一種或多種負責中鏈脂肪酸乙基酯合成的醇?；D移酶。體外酶活測定結果表明，醇酰基轉移酶Eht1p和Eeb1p兩者對長鏈脂肪酸酯幾乎沒有作用，推測可能由于酶的底物特異性，使得它們對底物的選擇性也存在明顯的不同；此外，醇?；D移酶Eht1p對C6酯的分解效果最強，而在相同的底物濃度下，醇?；D移酶Eeb1p催化合成辛酸乙酯的能力是Eht1p蛋白催化能力的10倍[55]。

近年來報道將醇?；D移酶基因轉入大腸桿菌（Escherichia coli）異源表達，在重組菌的大腸桿菌中，通過提高酰基輔酶A的生成量，并通過抑制其他消耗?；o酶A的路徑，使得酯類物質含量增加[63]。通過體外實驗證明，添加醇酰基轉移酶作用底物（酰基輔酶A）能有效的提高相應酯類物質的合成量[48]。2014年，KNIGHT M J等[64]利用TOP10超級感受態對Eht1p蛋白進行異源表達及純化，并通過連續偶聯酶測定法去表征重組酶醇?；D移酶Eht1p底物的偏好性和酶的動力學參數，通過動力學參數分析證明了其首選底物為辛酰基-輔酶A，并得到其對底物辛?；?輔酶A表現出最高的親和力，且直到?；滈L度增長到C14的時候其底物親和力才略有降低。LILLY M等[59，64-67]通過在工業酵母分別對Eeb1p和Eht1p進行了過表達，結果卻分別都能顯著地提高中鏈脂肪酸乙酯，特別是己酸乙酯、辛酸乙酯的含量[68]。因此，根據現有報道的結果可以看出，對于過表達EEB1和EHT1基因是否同時具有相對平衡的酯合成和酯水解活性存在著爭議，還有待后續實驗的探究。

此外，醇?；D移酶Eht1p還具有硫酯酶的活性，并且可以水解中鏈酰基輔酶A生成游離脂肪酸，但是，醇?；D移酶Eht1p無法水解對硝基苯基酰基酯，無法充當通用水解酶；醇-O-?；D移酶的主要代謝作用是從厭氧條件下開始，在酵母細胞逐漸積累中鏈?；o酶A的過程中回收游離的輔酶A；另外，游離的脂肪酸和乙醇均可抑制發酵和細胞生長，醇?；D移酶Eht1p可能被隔離在脂質顆粒/線粒體內，以促進蛋白質與?；o酶A和乙醇的相互作用，這一過程可能有利于脂肪酸酯乙酯的合成，以使脂肪酸和乙醇解毒[69-70]。目前，醇?；D移酶Eeb1p的動力學參數及酶學性質并未進行深入的研究，且醇酰基轉移酶Eeb1p和Eht1p的三級結構，目前均未解析，未來通過結構生物學的方式對其結構和功能的研究將成為研究重點。

2.3 乙酸異戊酯水解酶Iah1p負責釀酒酵母乙酸酯的水解

2.3.1 乙酸異戊酯水解酶Iah1p的酶學性質

乙酸異戊酯水解酶（isoamylacetate-hydrolyzingesterase，Iah1p）是酵母發酵過程中酯類化合物代謝的一個關鍵酶，它與醇乙?；D移酶（alcohol acetyltransferase，ATFase）共同調控著異戊醇與乙酰輔酶A縮合生成乙酸異戊酯的過程[61，71]。在乙基酯含量的影響下，與酯合成酶相比，酯水解酶研究較少。酯合成酶和酯酶之間的平衡，即酯水解酶，對乙酯的凈積累量起著決定性的作用[62]。酯酶催化酯的裂解，在某些條件下，催化酯鍵的形成，它是一類不同的水解酶。在酯類分解中，酯酶催化反應為RCOOR+H2O→ROH+RCOOH[72]。

FUKUDA K等[61，73]于1996年對酵母乙酰異戊醇水解酶進行克隆并鑒定。LILLY M等[59，74]研究證實，在IAH1基因缺失的酵母菌株發酵過程中，其乙酸異戊酯和其他酯類物質的含量顯著提高，但是當IAH1基因過表達時，乙酸乙酯、乙酸異戊酯、乙酸己酯和乙酸2-苯乙酯顯著降低。當底物pH值屬于中性范圍時該酶具有合成酯酶和酯水解酶的活性。此外，通過活性位點抑制研究發現，絲氨酸和半胱氨酸殘基均參與了乙酰異戊醇水解酶Iah1p酶的催化活性，且阻斷與半胱氨酸殘基相鄰的絲氨酸殘基會引起抑制，且Hg2+、對氯汞基苯甲酸酯（C7H5ClHgO2）和氟磷酸二異丙酯（C6H14FO3P）也同樣能抑制酶的活性；當通過計算機分析表明，乙酰異戊醇水解酶Iah1p包含一個活性位點的巰基，可將其歸為芳基酯酶[73]。

2.3.2 乙酸異戊酯水解酶Iah1p的結構分析

乙酰異戊醇水解酶IAH1基因長度為717 bp，編碼238個氨基酸，蛋白的分子質量大小為27.3 kDa。研究報道，羧酸酯酶和脂肪酶在活性中心具有必需的絲氨酸殘基，并且包含該絲氨酸殘基的活性位點的共有氨基酸序列為Gly-Xaa-Ser-Xaa-Gly[75-77]；而乙酰異戊醇水解酶Iah1p推測的活性位點基序具有與該描述共有序列相似的序列Ala85-Cys86-Ser87-Ala88-Gly89[61]。此外，AKOH C C等[78-79]研究發現，在乙酰異戊醇水解酶Iah1p的N端附近有一個獨特的GDSL序列基序和四個保守的序列區。

圖4 乙酰異戊醇水解酶Iah1p的晶體結構（A）、中央β-折疊片（B）、同二聚體型式（C）及亞基酶活性口袋（D）Fig.4 Crystal structure (A),central β-sheet (B),homodimer type (C)and subunit enzyme active pocket (D) of isoamyl acetatehydrolyticenzyme Iah1p

通過乙酰異戊醇水解酶Iah1p的晶體結構（圖4A）研究發現，該酶屬于SGNH-hydrolase家族；與同源序列對比后發現，其中央β-折疊片和催化活性殘基具有高度保守的結構（圖4B）；此外，乙酰異戊醇水解酶Iah1p是該家族中目前發現的唯一以二聚體形式存在的蛋白（圖4C），且不管是溶液還是晶體均是以同二聚體的形式存在，并通過實驗證實，該同二聚體對于蛋白的酶活和底物特異性有著重要的意義。由于乙酰異戊醇水解酶Iah1p所特有的一段C-temimus使得通過二聚化作用形成了另一個亞基酶活性口袋（圖4D），并首次發現二聚化作用參與了酶活性中心的形成并限制了酶的底物特異性[78]。

通過分析結構，可以將乙酰異戊醇水解酶Iah1p的活性口袋根據其功能分為三層，第一和三層（上下層）包含了結合酯類的疏水性側鏈，第二層（中間層）進行催化三聯體催化的水解反應。通過對結構模型進行分析，推測底物進入活性口袋后，其長的疏水性側鏈應當更加傾向于留在活性口袋的上部，甚至延伸至溶劑區。根據其結果進一步推測乙酰異戊醇水解酶Iah1p的殘基Lys52和Trpl29可以在底物進入活性中心后，為底物提供疏水性位點的側鏈[79-80]。

3 結論與展望

本文闡述了合成酯類的一大類醇?；D移酶，其中包括乙酸酯酶和乙基酯酶；乙酸酯酶的Atf1p和Atf2p主要負責乙酸乙酯和乙酸異戊酯等酯類物質的合成，由于兩者酶學性質的不同及生理活性的差異，使得兩者具有不同的生理功能：Atf1p比酶活力高于Atf2p，Atf2p有助于細胞解毒；乙基酯的Eht1p和Eeb1p主要負責己酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯等中鏈脂肪酸的合成，通過過表達、序列預測及異源表達等方法，研究其酶學性質及序列。

近幾年關于釀酒酵母?；D移酶在葡萄酒、啤酒等應用中的報道較多，但在白酒中的研究和應用報道寥寥可數。對白酒發酵過程中發酵產酯、生香機理、機制分子層面的認識，可以使相關科研人員從根本上獲得發酵過程中微生物分子水平層面作用的一些重要參數和指標，對于亟待國際化的中國白酒而言，迫切需要一套各項生產參數均可量化的標準。只有這樣，中國白酒方能真正在國際上站穩腳跟，贏得世界范圍內的白酒市場。